影响限制性内切酶活性的因素

1.生物技术概念与特征定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。

2.基因工程的概念利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程3.PCR反应体系基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成4.PCR反应参数：高温变性(94)，低温退火（60），适温延伸（72）5.PCR反应体系：（1）模板DNA（2）特异性引物dNTP（3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）（4）缓冲溶液6.PCR反应原则：引物原则：（1）引物扩增跨度（2）引物解链温度（3）避免引物内部或引物之间存在互补序列（4）G+C含量：尽量控制在40%至60%之间（5）引物的3‘末端特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对（6）引物中有或能加上合适的酶切位点7.分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

用途：（1）研究DNA之间的亲缘关系（2）发现基因的缺失或突变；（3）测定某种遗传信息的量（4）鉴定某种基因（5）基因治疗8.常用分子杂交类型：（1）DNA印迹技术Southern blotting（2）RNA印渍技术Northern blotting（3）蛋白质印渍技术Western blotting（4）斑点印迹Dot blotting（5）原位杂交in situ hybridization9.DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)10.Sanger双脱氧链终止法原理：（1）Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。

它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。

另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。

限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。

实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。

在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。

该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。

因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。

从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。

但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。

虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。

经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。

突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。

名词说明1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。

2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。

3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。

4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。

5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。

连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。

7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。

8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。

10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。

那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。

实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。

不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。

从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。

常用的筛选方法有两类。

一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。

另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。

这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。

lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。

重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。

因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。

这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。

本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。

不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。

一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。

DNA甲基化，附有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。

由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V/V）会抑制内切酶活性，因此在20μl 反应体系中，甘油浓度应少于lμl。

用2种酶消化DNA时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。

由于loadingbuffer中有高浓度的甘油，因此加入loadingbuffer后会是酶失活。

酶切实验中的注意事项:1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。

2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。

3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底4）DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。

如果楼主得试剂和步骤是正确，既排除了其他因素（试剂，体系，有没有混匀等）。

因为大多数内切酶失活，都是因为酶蛋白本身结构得不可逆改变，各种亚基团不稳定至分离等（如甘油得浓度增大，温度增大65度以上）。

所以，向楼主说得在室温放置一个小时，一般不会失活，只是酶切效率降低而已，但反应还是进行得，这样酶就在消耗，酶本身得活性基团在分离，再拿到37度，效率肯定会低，甚至没活性，导致酶切看不到条带（如果你的酶切片断小得话，拿PAGE跑，可能会看到带）。

基因工程复习题一、名词解释 201.转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。

2.转染：以噬菌体为载体，不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA 环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。

3.质粒：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

4.基因库：特定生物体全基因组的集合（天然存在）。

5.转化率：每μgDNA转化成功的细菌克隆数。

6.同尾酶：来源和识别序列不同，但能切出相同的粘性末端的限制性内切酶。

7.同裂酶：来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。

8.Ti质粒：在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。

9.SD序列：mRNA的核糖体结合位点，含有一个启始密码子和一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，3-9个核苷酸,富含嘌呤,位于起始密码子上游3-11个核苷酸处10.cos位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

11.基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

12.报告基因：编码产物能够被快速测定、不依赖于外界压力的一类基因。

13.平台效应：PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。

14.受体细胞：是能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞。

15.cDNA library：将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。

16.穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件？1）具有⾃主复制能⼒，保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染⾊体DNA分开，便于分离提纯3）分⼦质量相对较⼩，易与操作，并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4）具多个单⼀限制性内切酶位点，便于⽬的基因克隆5）有⼀个或多个筛选标记（如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等）6）具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型？各有什么特点？限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。

Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。

均需ATP ⽔解供能。

Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。

识别序列是⾮对称的，现在已知的酶数量相当少。

Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。

Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽，通常以同源⼆聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。

⽆需ATP⽔解供能，仅需Mg2﹢参与。

具有序列特异性，可对靶DNA进⾏精确切割，在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。

三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些？DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤？1）作为DNA重组技术的重要⼯具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键，组成新的重组DNA分⼦。

2）在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤，这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点？1）具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2）可主动感染分裂细胞3）感染细胞后，病毒基因组反转录⽣成双链DNA，可整合到宿主染⾊体中，与染⾊体同时复制，持续表达外源基因4）基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点？1）可插⼊⼤⽚段外源基因，可达35kb2）宿主范围⼴，尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染⾮分裂细胞4）病毒滴度⾼，可达10^9-10^11pfu/ml5）可原位感染组织，如肺等6）重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上，⽽是游离于染⾊体外瞬时表达，安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜？①病毒基因组较⼤，构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞，缺乏特异性③载体不发⽣整合，导致⽬的基因只能短暂表达，因此需要重复应⽤，可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。