限制性内切酶和引物

反向pcr原理反向PCR（Reverse PCR）是一种常用的PCR技术，用于在DNA序列未知的情况下，扩增目标DNA片段的两端序列。

它通过反向延伸的方式，从目标序列的内部区域扩增出未知序列的两端，以便进一步的克隆和分析。

本文将介绍反向PCR的原理、方法和应用。

一、原理反向PCR的原理基于PCR技术，但与常规PCR有所不同。

常规PCR是通过设计引物扩增已知序列的DNA片段，而反向PCR则是通过设计引物扩增未知序列的两端。

其基本步骤包括DNA片段的限制性内切酶切割、反向连接、PCR扩增和测序分析。

目标DNA片段被限制性内切酶切割生成两个互补的末端。

然后，这些末端通过反向连接，形成一个环状的DNA分子。

接下来，使用引物对环状DNA进行PCR扩增，以得到目标DNA片段的两端序列。

最后，通过测序分析，可以确定目标DNA片段的未知序列。

二、方法反向PCR的方法包括样品处理、引物设计、PCR扩增和测序分析。

样品处理：从待扩增的DNA样品中提取DNA，并进行限制性内切酶切割。

酶切割产生的DNA片段应具有一定的长度，以便进行反向连接。

引物设计：设计两对引物，分别位于目标DNA片段的内部和外部。

内部引物用于反向连接后的PCR扩增，外部引物用于验证扩增产物的特异性。

PCR扩增：将反向连接后的DNA作为模板，使用内部引物进行PCR 扩增。

PCR条件根据具体实验需求进行优化。

测序分析：对PCR扩增产物进行测序分析，以确定目标DNA片段的未知序列。

三、应用反向PCR在生物学研究中有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1.基因组测序：反向PCR可用于扩增未知序列的两端，以便进行全基因组测序或特定基因的测序。

2.基因克隆：通过反向PCR扩增未知序列的两端，可以获得目标基因的完整序列，从而进行基因克隆和功能研究。

3.基因突变分析：反向PCR可以用于检测基因的突变位点，并进一步研究突变对基因功能的影响。

4.基因组重排检测：反向PCR可用于检测基因组的重排事件，如基因重排、染色体倒位等。

简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。

基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。

1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。

现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。

若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。

因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。

1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。

平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。

以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

请根据以下图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。

表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。

请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。

无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。

先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。

常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。

下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。

先介绍一下什么是II型内切酶吧。

The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。

基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。

粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。

Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。

转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。

基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。

目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。

连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。

转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。

停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。

逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。

PCR: 即聚合酶链式反应。

在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。

α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。

引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。

但这就需要你仔细设计引物。

连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。

（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。

因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。

我看promega的说明书上说，最好隔四个。

还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

最好使用酶切效率高的。

最好使用双酶切有共同buffer的酶。

最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。

Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。

其实园子里有很多的解释了。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。

不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。

实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。

二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。

Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。

引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于引导限制性内切酶切割特定的DNA序列。

其原理如下：
1. 设计引物：首先，根据需要切割的DNA序列，设计两个引物。

这两个引物通常位于目标序列的两端，其序列会与目标序列的末端互补配对。

引物的设计要求尽可能准确，以确保引物与目标序列的互补配对能够稳定形成。

2. 引物结合：将设计好的引物与待切割的DNA序列加热至高温，使其双链DNA解链。

随后，将体系温度降低，使引物与DNA序列的互补链能够重新结合。

3. 添加限制性内切酶：在引物结合的体系中添加限制性内切酶。

限制性内切酶是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶。

它
们通常与特定的核酸序列互作，并在该序列特定的位置引发剪切作用。

4. 酶切：限制性内切酶与DNA序列中的酶切位点结合，以酶
切作用切割DNA链。

由于引物结合形成的DNA序列中引入
了酶切位点，因此限制性内切酶能够在这些位点上发挥作用，导致DNA序列在酶切位点处断裂。

5. 分析：酶切作用后，可通过各种分析方法来检测DNA序列
的切割情况。

常见的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应（PCR）、或者直接观察DNA条带的可见性。

总结起来，在引物加酶切位点的方法中，引物的设计与酶切位点的结合是关键步骤。

通过合理设计引物，并选择适合的限制性内切酶，可以实现精确的DNA序列切割。

这对于分子生物
学研究、基因工程、或者遗传性疾病诊断等领域具有重要意义。

基因克隆与表达的研究方法基因克隆和表达是生命科学中重要的研究方法，它们在基因工程、药物研发、癌症治疗等领域发挥着重要作用。

在克隆和表达一个基因之前，需要先建立一个可重复的实验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。

本文将介绍基因克隆和表达的一些通用方法和技术。

1. PCR扩增PCR扩增是一种常用的克隆方法，它可以在短时间内高效地扩增DNA序列。

这种方法需要一对引物，在PCR反应中引物定向扩增目标序列。

PCR反应需要一个DNA模板、引物和聚合酶，在合适的反应条件和温度下进行。

PCR扩增后的产物可以纯化、酶切、克隆到表达载体上。

2. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化是一种分子生物学技术，可以将DNA分子切成不同的长度，并生成暴露的粘性末端。

这样的末端可以与其他的DNA分子的互补末端连接起来，从而实现DNA的克隆。

在DNA克隆中，选择合适的限制性内切酶可以实现目标DNA序列的克隆。

3. 匀浆凝胶电泳匀浆凝胶电泳是一种检测DNA大小的技术，它可以用于确认PCR扩增产物的大小，鉴定DNA克隆的有效性以及纯化DNA等。

在匀浆凝胶电泳中，DNA样品被负载到凝胶上，并在电场作用下迁移。

根据DNA分子大小的不同，可以通过在凝胶上形成特定的DNA带和条带，从而检测DNA分子的大小。

4. 蛋白表达的研究方法蛋白表达是生命科学研究中重要的实验方法，可以获得对生命过程和重要分子的深入了解。

在蛋白表达中，需要克隆一个给定的基因到一个特定的表达载体上。

表达载体中包含能够转录和翻译蛋白质所需的所有元件。

在表达系统中，可以使用细胞培养、原核生物、真核生物等不同的宿主来表达蛋白。

5. 功能分析的研究方法在获得基因克隆和表达蛋白之后，需要通过功能分析进一步了解目标基因和蛋白的生物学功能。

在功能分析中，常用的方法包括基因敲除、蛋白互作、基因组学、蛋白质修饰等。

通过这些方法，可以深入研究生物学体系的信号传导、调节机制、发育和疾病机制等问题。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。

2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。

3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。

二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。

2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。

3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。

4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。

一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。

5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。

6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。

三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。

合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。

2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。

3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。

同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。

4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。

同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。

5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。

四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。