限制性内切酶的应用 ppt课件

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江西省新余市第四中学高三一轮复习人教版生物选修三课件专题111限制性核酸内切酶(共12张PPT)

多能产生不同的DNA片段种类数是（）
A.3 B.4
C.9 D.12
C
8、一环状DNA分子，设其长度为1，已知某种限制性核酸内切酶在该分子上有3个酶切位点，如图中箭头A、B、C所指。如果该 DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生0.2、0.3、0.5 三种不同长度的DNA片段。现有多个上述DNA分子，若在每个分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些DNA分子最多能产生长度不同的线状DNA的种类数是（）
图2 图1
（4）若用图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后形成重组
质粒，则应该选择的限制酶是 BamHⅠ 。在导入重组质粒后，为
筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需用添加抗生素B 的培养基。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确
表达，其最可能的原因是
。
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
A 作正确的是（）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
4、下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图 (↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端)：
C 请指出下列哪组表达正确（）
少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些
C 线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）
A.3 B.4
C.9 D.12
7、如果一个环状DNA上有三种限制酶a、b、c的酶切位点。现有
多个该环状DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点
被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些环状DNA分子最

限制性内切酶应用.pptx

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II型限制性内切酶的分类（一）
❖
内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和
Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类
酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都
以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的
是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到
DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的
位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开
DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们
识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门
切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到
DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此
序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的
功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
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一些概念
❖粘末端和平末端 ❖同尾酶 ❖同裂酶 ❖同识异切酶 ❖消化 ❖星号活力
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同裂酶和同尾酶：
同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限
制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，用Southern blot分析方法和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分析。

限制性内切酶ppt

限制性内切酶
细菌可以抵御病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
一、限制-修饰现象的发现
表1
从表1可看出，从三种不同的E.coli菌株中繁殖出来的λ噬菌体的后代(分别用λK、λ B 、 λC表示)，再接种到同样菌株，接种效率都是 1。
但如果接种到不同的菌株中，如λK在B株上接种效率只有10-4，而不管λK还是λB在C株上的接种效率都为1。
Answer: 幸存者的后代因为有新寄主的修饰标记而缺少祖代寄主的修饰标记，只能感染新的寄主类型，而不再能感染祖代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质粒和噬菌体。
host restriciton enzymes.
Once methylated however, all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemimethylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction.
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。
对表1的解释：
不同的菌株可能有不同的限制修饰系统。当不同来源的噬菌体λ进入另一种大肠杆菌时，绝大部分被限制酶所降解，但有极少数的入噬菌体先被大肠杆菌的甲基化酶所修饰，因而幸存下来.

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)

1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!

限制性内切酶原理PPT.

AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
小提示24：申请表为每个应聘者提供了同等的竞赛场地。
如45．’你同N意，N我G们应C将聘把者G你工G的作C资变料动C存是G档否，合C以情N备合来理N日。3之‘需。（询问应聘者5是’否同N意N将N其G资料C存-O档。H）
限制性内切酶原理
限制酶
II型限制酶
1
限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。
限制性核酸内切酶
分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。
II型限制酶所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名种名株系编号
切割频率
切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。
前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT

7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小，亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是：

限制性内切酶.正式版PPT文档

回文序列 • 5'......GAA TTC......3' • 3'......CTT AAG......5'
• 从两侧读都是核苷酸的序列都是5'-GAATTC-3'
限制性内切酶的命名
• 限制性核酸内切酶的命名最早由 ห้องสมุดไป่ตู้mith 等1973 年提出,。
• 1980 年 Robert s 进行系统化和分类。
同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的。它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行末
端连接。以下几种酶产生的末端是相同的· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
限制性内切酶的切割方式
影响限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型酶对DNA序列的识别一般具有以下几个特征
①大多数酶的识别序列很严格，少有变动的余地
②识别序列的碱基数一般为4~8对，一般都富含C和G. ③大多数识别位点具有180度旋转对称的回文序列，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读都完全相同。
④识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割效果
限制性内切酶
主要内容 • 限制性内切酶的概念 • 限制性内切酶图谱 • 限制性内切酶的图谱分析法
限制性内切酶
是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧核糖核酸酶，限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点

高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件

质粒DNA的酶切鉴定
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察分析仪上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system

限制性内切酶的应用

限制性内切酶在生物传感器中的优势：高特异性、高灵敏度、操作简便等
基因组测序：限制性内切酶在DNA片段的精确切割中起到关键作用，是基因组测序的基础步骤之一。
分子生物学研究：限制性内切酶在分子生物学研究中用于制备特定DNA片段，是基因克隆、基因表达和基因功能研究的重要工具。
生物技术药物开发：限制性内切酶在生物技术药物开发中用于对目的基因进行精确的切割和调控，从而实现基因治疗和基因疫苗等创新药物的开发。
在基因表达研究中的应用：通过限制性内切酶对基因进行切割，可以研究基因的表达调控机制。
在疾病诊断中的应用：限制性内切酶可以用于检测特定的基因突变或变异，有助于疾病的早期诊断。
在个性化医疗中的应用：限制性内切酶可以用于编辑患者的基因，为个性化医疗提供技术支持。
限制性内切酶在基因编辑技术中的应用，如CRISPRCas9系统，可用于创建疾病模型，以研究疾病的发病机制和治疗方法。
合成生物学：限制性内切酶在合成生物学领域中用于设计和构建人工生物系统，从而实现精确控制细胞代谢和行为的目的。
PART SIX
伦理问题：基因编辑技术可能引发人类基因库的污染，对人类生命尊严和伦理道德造成威胁。
法律问题：基因编辑技术可能违反法律法规，对人类基因库的改变和干预需要得到相关部门的批准和监管。
责任问题：基因编辑技术可能引发责任问题，例如对基因编辑技术的滥用、误用等行为需要承担相应的法律责任。
透明度问题：基因编辑技术需要公开透明，对技术的使用和结果需要向公众和相关部门进行报告和公示。
安全性问题：限制性内切酶在基因治疗中的使用可能引发不可预测的副作用和风险
法律问题：限制性内切酶的使用和基因治疗的应用需要遵守相关法律法规和伦理准则，以确保安全性和合法性

实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切完整PPT

2) 命名原则
• 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名 (genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
Eco R V (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 p U C 1 8 M C S lacZ prom oter
35S prom oter
Eco R V (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP N O S 终止子加尾信号
T-D N A right border
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。
T ×C第CGG四6步mA：TC 再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 dam甲基化酶识别序列切割位点应用多功能单功能
双功能
异源三聚体
同源三聚体
异源二聚体
ATP、 Mg2+ 、SAM
Mg2+
ATP、 Mg2+
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
识别序列内或附近特异切割
随机性切割
不常用
常用
数量很少，无实际作用

基因工程中工具酶.限制酶的应用ppt课件

1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。
徐师大-屈艾老师制作
.
7
l
徐师大-屈艾老师制作
.
8
徐师大-屈艾老师制作
.
9
二．核酸内切限制酶的类型及切割频率 1、类型
特性
I型
（7项）
II型
III型
限制和修饰活性
单一多功能的酶
徐师大-屈艾老师制作
.
22
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3’-OH的单链粘性末端
5'-CTGCA G-3,
5’-CTGCA-OH-3’
P-G-3，
3'-G ACGTC-5，
3'-G -P + ‘3- HO-ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端
5'-G |AATTC-3’ 3'-CTTAA| G-5’
分开的核酸内切酶和甲基化酶
具有一种共同亚基的双功能的酶
核酸内切限制酶的蛋白质结构
徐师大-屈艾老师制作
3 种不同的单链多肽亚基
.
2种不同的亚基
10
切割位点距离识别位点的情况
甲基化作用的位点
在距寄主特异性位点至少 1000bp 的地方可能随机地切割
寄主特异性的位点
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化：
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。

限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件

ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则：第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名第二、三个字母（小写）：该细胞的种名第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶：在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株
5. 换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要

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限制性内切酶的应用
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体
的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二
限制性内切酶的应用
一些概念
❖ 粘末端和平末端 ❖ 同尾酶 ❖ 同裂酶 Biblioteka 同识异切酶 ❖ 消化 ❖ 星号活力
限制性内切酶的应用
同裂酶和同尾酶：
同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内
切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ 和MspⅠ的识别顺序都是
❖ 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的主要功能
❖ 保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。
限制性内切酶的应用
病毒免疫室
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的发现
❖ 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是
在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的分类
❖ III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。
聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶
在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可
能更高。
限制性内切酶的应用
II型限制性内切酶的分类（三）
❖ 第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与 DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
❖ 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的特点
❖ 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大
❖ 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现
限制性内切酶的分类
❖
按照亚基组成、酶切位置、识别位点、
辅助因子等因素划分为三大类
❖ I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管 I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备实用性。
限制性内切酶的应用
❖ 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏
❖ 限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些RM系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的命名
限制性内切酶命名的次序如下： ❖ A）用3个字母代表来源的生物（如Bam代
表 Bacillus amyloliquefaciens） ❖ B） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株
（BamH） ❖ C） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序
（BamHI）
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的应用
II型限制性内切酶的分类（一）
❖ 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I 这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。
5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基
限制性内切酶的应用
限制性内切酶的分类
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II型酶在其识别位点之中或临近的确定位
点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片
段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯
一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内
切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，
因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能
与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。