青霉素生产工艺
摘要：青霉素是人类最早发现的一种极其重要的抗生素,其杀伤革兰氏阳性细菌的神奇功效在二战中挽救了众多士兵的生命。它的发现对药物学乃至整个人类发展的重要意义。本文将对青霉素的生产工艺及其提取进行深入的讲解。
关键词：青霉素生产工艺发酵提取
一、青霉素的生物学特性
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中1种,在分类上属于A类，酶的活性位点
上有丝氨酸，又称活性位点丝氨酸酶，其作用机制是水解β-内酰胺类抗生素
的β-内酰胺环，使抗生素失去活性。由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,
而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应
外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生
的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾
盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以
免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。
二、青霉素的发酵
青霉素的发酵生产的一般工艺流程：
青霉素生产菌不同，发酵工业也有区别。
丝状菌的青霉素发酵工艺流程：沙土管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～
7d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，6～7d）→种子罐（种子培养，25℃，
40～45h）→繁殖罐（种子培养，25℃，13～15h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐
球状菌的青霉素发酵工艺流程：冷冻管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～8d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，8～10d）→种子罐（种子培养，28℃，50～60h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐
青霉素的分批发酵分为菌丝生长和产物合成两个阶段，进入合成阶段的必要条件是降低菌丝的生长速率。影响青霉素发酵产率的因素有环境和生理因素两个方面，前者包括温度、PH、培养基种类及浓度、溶解氧饱和度等；后者包括菌体浓度、菌体生长速率、菌丝形态等。
菌体生长和青霉素合成最适温度并不相同，一般前阶段略高于后阶段。因此，在菌体生长阶段可以采取较高温度，以缩短生长时间，而到达产物合成阶段，应适当降低温度，以利于青霉素的合成。青霉素发酵的最适PH一般在6.5左右，由于青霉素在碱性条件下不稳定，容易发生水解，因此应尽量避免PH超过7.0。三、青霉素发酵过程控制
反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。带放量10％，发酵时间24h。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。
在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。
（1）培养基
青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。
碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。
当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。降低成本。
氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。
无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30µg/ml以下。
流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6％左右，pH开始升高时加糖。补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。
添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。
（2）温度
一生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。但20℃青霉素破坏少，周期很长。生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。前期控制25－26℃左右，后期降温控制23℃。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。
（3）pH
合成的适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。前期pH控制在5.7~6.3，中后期pH控制6.3~6.6，通过补加氨水进行调节。pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。
（4）溶氧
溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，则造成不可逆的损害。所以不能低于30％饱和溶氧浓度。通气比一般为1：0.8VVM。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混
合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。
（5）菌丝生长速度与形态、浓度
对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。
（6）消沫
发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。
四、青霉素的提取
青霉素提纯工艺流程简图：
青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。
1.发酵液预处理
发酵液放罐后，首先要冷却，因为青霉素在低温时比较稳定，细菌繁殖也比较慢，可避免青霉素迅速被破坏。青霉素菌丝教粗，一般过滤较容易，通常采用鼓式过滤及板框过滤；蛋白质的处理方法包括等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、凝聚剂沉淀、絮凝剂沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高价金属离子的去除方法有离子交换法和沉淀法等。
2. 过滤
发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。
（1）菌丝体粗长10µm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。
（2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。
