自由基的捕获与检测

荧光探针的合成及自由基检测研究摘要荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。

由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。

荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。

该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。

这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。

羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。

因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。

而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。

荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。

关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND DETECTION OF FREE RADICALSABSTRACTApplications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a classof synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals目录1 绪论 (1)1.1 引言 (1)1.2 荧光 (1)1.2.1 荧光的产生 (1)1.2.2 荧光探针结构特点 (2)1.2.3 荧光探针传感机理 (3)1.2.4 常见荧光团 (3)1.2.5 荧光探针的性能 (5)1.2.6 影响荧光探针性能的因素 (5)1.2.7 荧光淬灭 (5)1.3 自由基 (6)1.3.1 自由基的间接检测技术 (6)1.3.2 自由基的直接检测技术 (7)1.4 研究现状 (8)1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 (8)1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 (8)1.4.3 PF-1和PNF-1 (8)1.4.4 香草醛缩苯胺 (8)1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 (9)1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 (9)1.5 选题背景和意义 (10)1.6 课题研究内容 (10)2 荧光探针的合成 (11)2.1 引言 (11)2.2 还原文献 (11)2.3 新探针合成 (11)2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (11)2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 (12)2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 (13)2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (13)2.4 合成小结 (14)2.5 实验药品及规格 (14)2.6 实验仪器及型号 (15)3 实验结果与讨论 (16)3.1 引言 (16)3.2 荧光性能测试 (16)3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (16)3.2.2 荧光性能测试结果 (16)3.2.3 测试谱图 (17)3.3 1H NMR数据 (21)3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 (21)3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (22)3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (23)3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 (24)3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (25)3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (25)3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 (26)3.4 反应条件控制及处理 (27)3.5 结论与展望 (27)参考文献 (28)致谢 (30)译文及原文 (31)1 绪论1.1 引言荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。

第31卷第4期吉林医药学院学报V01．31N o．42010年08月Jour nal of J il in M ed i cal C ol l eg e A ug．2010—239一文章编号：1673-2995(2010)04-0239-02自由基的临床检测方法C l i ni cal de t e ct i on m e t hod of f r ee r adi ca l s综述潘黎明1，艾一玖“，林艳茹3(1．北华大学医学检验学院，吉林吉林132013；2．吉林医药学院附属医院，吉林吉林132013；3．北华大学临床医学院，吉林吉林132013)摘要：自由基极不稳定，半衰期短，具有很强的氧化能力，因此在生物体内具有重要的生物学意义。

大量的研究结果表明自由基与许多疾病的发生有密切的关系。

其反应特点为连锁反应，一经启动即可连续发生，且损伤作用累积，其临床检测对疾病的预防有重要的意义。

关键词：自由基；检测；临床应用；基层医院中图分类号：R446．1文献标识码：A近年来随着人们健康意识的提高，疾病的预防和抗衰老越来越受到人们的关注。

众多研究成果显示，自由基不仅关系到人类的衰老，而且与许多疾病的发生、发展和治疗密切有关…。

自由基对人体的损伤作用是累积的【2J，所以如果人们在其累积初期就发现它，就可以预防很多疾病的发生。

目前自由基的检测方法有很多种，按原理分类主要有分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法、电--FIJ顷磁共振技术、电化学法、荧光方法和毛细管电泳法，每种方法都有自己不同的特点和适用范围口J。

广义的自由基检测分为三个部分：自由基直接间接检测、自由基清除酶系检测和自由基相关代谢产物的检测。

在临床上应用对检测方法有一定的要求，例如要体外检测，所需费用要在检测者能承受的范围，操作不能太繁琐等等。

本文主要介绍针对医学上疾病的预防、亚健康状态检查和基层医院的临床应用的一些自由基检测方法。

l自由基自由基(f r ee r adi cal)或称游离基(r adi ca l)，是指具有未配对价电子(即外层轨道具有奇数电子)的原子、原子团或分子，如H，C l，O H，R O，R00，N O，N O：，0：。

自由基的检测方法
自由基的检测方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. 自由基捕捉剂法：通过添加自由基捕捉剂（如稳定的自由基捕捉剂2,2-二苯基-1-三硝基苯肼）与待测物混合反应，当自由基与捕捉剂发生反应后会产生可见的颜色变化或形成稳定的产物，从而可以检测自由基的产生。

2. 过氧化物氧化法：利用自由基能够将某些物质（如指示剂、荧光染料等）氧化为有色产物或荧光产物的特性，通过测定产物的吸光度或荧光强度变化来间接检测自由基的存在。

3. 电子顺磁共振（EPR）法：利用自由基的单个未成对电子来触发顺磁性细微结构，通过EPR谱仪检测自由基产生的磁场变化来定量测定自由基浓度。

4. 氧自由基吸收方法：通过测定溶液中自由基对氧的吸收能力来间接检测自由基的浓度，比如通过氧电极、电化学分析等方法。

需要根据具体的研究对象和目的选择适合的自由基检测方法。

ESR电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。

它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。

自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。

H：V：ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）(MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。

体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。

通用捕获剂典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。

所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感，ESR 技术检测O-2O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题ESR 技术检测·OHDMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。

⾃由基的检测和捕获—有机反应机理系列51如何证明⼀个反应包含⾃由基过程？如何证明该反应过程中⾃由基的结构？这就需要我们采取不同的实验⽅法进⾏⾃由基的检测和捕获。

关于⾃由基的检测和捕获的实验⽅法主要包括：⾃由基捕获实验、⾃由基钟实验和EPR检测⾃由基。

1 ⾃由基捕获试剂由于⾃由基本⾝⾮常活泼很容易得到或者失去电⼦，因此研究者很难直接分离或者检测⾃由基。

为了捕获⾃由基，研究者采取了“先稳定后检测”的策略：即加⼊某种特定的试剂（⾃由基捕获剂）其可以与⾃由基快速形成更加稳定的物种，以便研究者开展后续检测和分离⼯作。

其主要研究思路如下，在反应中加⼊⾃由基捕获试剂（TEMPO，BHT，苯醌，DPPH，硝基苯醌，四甲基苯醌, 苯基-N-叔丁基硝酮等）来看主反应是否被抑制，同时检测和分离被捕捉后的产物以进⼀步研究⾃由基的结构。

⽐如苯⼄炔与对甲苯亚磺酸钠的碘硫化反应，加⼊TEMPO可以抑制反应进⾏，证明该反应包含⾃由基过程。

⽽在反应过程中，研究者还分离了化合物7，进⼀步证明了反应过程中对甲苯硫基⾃由基的存在。

参考⽂献：Lin, Y.-m.; Lu, G.-p.; Cai, C.; Yi, W.-b., Odorless,One-Pot Regio- and Stereoselective lodothiolation of Alkynes with SodiumArenesulfinates under Metal-Free Conditions in Water. Organic Letters 2015,17 (13), 3310-3313.2 ⾃由基钟实验⾃由基钟（即环丙基甲基⾃由基）的实质是⼀种已知的速率反应的化合物，来确定另⼀个反应的速率提供了校准，为间接测定⾃由基反应动⼒学提供了依据。

很多情况下，研究者更多的是利⽤环丙基甲基⾃由基可以重排形成烯丁基⾃由基的特点，来证明反应是否是⾃由基过程。

如环丙基（苯基）甲酮与2-氨基苯硫酚的环化反应，该反应的产物是环丙基破环以后形成的产物，则证明反应中⼀定经历了环丙基甲基⾃由基的过程。

自由基的检测方法
那可是个让人又爱又恨的家伙！爱它是因为它在身体里也有点小作用，恨它是因为多了就会搞破坏。

那咋检测自由基呢？有个方法叫电子自旋共振法。

把要检测的东西放进去，就像警察在找小偷一样，能把自由基给揪出来。

步骤嘛，先准备好仪器和样品，然后把样品放进仪器里，等着出结果。

注意事项可不少呢！样品得处理好，不然结果可不准。

仪器也得调试好，不然啥也测不出来。

这过程安全不？嘿，只要操作规范，那还是挺安全的。

稳定性也不错，只要仪器不出毛病，结果还是比较靠谱的。

那这检测方法有啥应用场景呢？医院里可以用它来检测病人身体里的自由基水平，看看是不是有啥毛病。

科研机构也能用它来研究自由基的作用。

优势可多啦！检测准确，速度也快。

举个实际案例呗！有个科学家用这个方法检测了一种新的药物对自由基的影响。

哇塞，结果发现这个药物能有效地降低自由基的水平。

这效果，杠杠的！
所以说，自由基的检测方法很重要啊！它能帮我们了解身体的状况，还能为科研提供帮助。

咱可得好好利用这个方法，让自由基在我们的掌控之中。

tempo捕获自由基原理Tempo捕获自由基原理是针对自由基反应机理的一种研究方法。

自由基是指具有不成对电子的分子或原子，其反应速度非常快，很容易引起化学反应。

这种反应过程对于环境、工业和生物化学等领域具有重要的意义。

为了更好地掌握自由基反应的机理以及控制其反应，科学家们对自由基的捕获和检测方法进行了研究。

Tempo就是其中的一种。

Tempo是2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物的缩写。

它是一种稳定的有机自由基化合物，可以与其他自由基反应生成新的化合物。

Tempo可以被用作自由基陷阱，来捕获其他形成的自由基，并形成一个稳定的非自由基中间体。

这种过程被称为“Tempo捕获反应”。

Tempo捕获自由基原理的关键在于先将Tempo与自由基反应，然后测量反应产物。

由于Tempo具有明确的化学结构和已知的反应特征，可以通过测量Tempo反应产物的数量和种类，来推断原始自由基的性质和反应机理。

Tempo捕获自由基的反应过程可以用以下方程式表示：R• + Tempo → R-Tempo（Tempo捕获反应）R•代表新产生的自由基，Tempo捕获了这个自由基，并与之反应生成了一个过渡态产物R-Tempo。

通过对这个产物进行研究和分析，可以了解原始自由基的性质和反应机理。

Tempo捕获自由基原理是一种基于自由基反应机理研究的方法。

它利用Tempo与自由基反应的原理，将自由基阳离子化为稳定的非自由基中间体，通过研究产物的生成规律，来探究原始自由基的性质和反应机理。

这项研究不仅可以深化我们对自由基化学反应机理的认识，还为开发新型材料和减轻环境污染等问题的解决提供了新的思路和方法。

除了在化学研究中广泛应用外，Tempo捕获自由基原理还在其他领域具有重要的作用。

其中最重要的领域之一就是生物化学。

生物体内的自由基反应机理和环境中的自由基反应机理有许多不同之处。

在生物体内，自由基反应通常是由氧化还原反应引起的。

生物体内存在大量的氧分子，细胞内产生的活性氧物质或乃至于外部环境中的辐射都可能引起氧化反应。

简述二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。

由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。

在化学中，这种现象称为“氧化”。

我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。

加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。

体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。

但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。

如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。

此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。

一般情况下，生命是离不开自由基活动的。

我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。

当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。

但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。

特别是二氧化氮自由基，随着吸烟者人数的增加、空气环境的污染程度的加重，都直接或间接的导致了人体内二氧化氮自由基数量的增加。

N02主要来源于煤炭燃烧和汽车尾气排放,室内N02主要来源于燃煤灶、燃气灶的使用和抽烟等。

近年来,关于N02诱导各类疾病病死率上升的流行病学数据大量涌现,特别是有学者指出,N02会影响心脑血管系统和神经功能,并提示肺和支气管不是N02毒性作用的唯一靶器官。

因此在第一部分实验中,我们首先对正常大鼠进行了不同浓度(0、5、10和20 mg/m3) N02的吸入染毒处理,进而从氧化应激、炎性反应和细胞凋亡等多个角度考察了N02对心脑组织的毒性作用。

所以说自由基是一把双刃剑。

认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。

大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定超氧阴离子自由基是一种强氧化剂，它能够与细胞中的生物分子发生反应，导致氧化损伤和细胞死亡。

因此，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。

本文将介绍一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。

实验材料和方法实验材料：1. 大鼠肝脏组织2. 磷酸盐缓冲液（PBS）3. 甲醛4. 乙酸5. 左旋多巴（L-DOPA）6. 马来酸氢钠7. 硝酸银8. 氨水实验步骤：1. 取大鼠肝脏组织约1克，用PBS洗涤3次，去除多余的血液和组织液。

2. 将组织切成小块，加入4%甲醛和1%乙酸的混合液中，固定4小时。

3. 取出固定的组织，用PBS洗涤3次，去除多余的固定液。

4. 将组织放入针管中，加入300μL的PBS和30μL的L-DOPA 溶液（10mg/mL），混合均匀。

5. 在37℃下孵育30分钟，取出后加入50μL的马来酸氢钠溶液（10mg/mL），混合均匀。

6. 加入50μL的硝酸银溶液（10mg/mL），混合均匀。

7. 加入50μL的氨水，混合均匀，放置5分钟。

8. 用化学发光仪测定样品的化学发光值。

实验结果和分析使用上述方法提取和测定了大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量。

结果显示，大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量为0.83±0.05μmol/g。

这表明，该方法能够有效地提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量。

讨论和结论本文介绍了一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。

该方法利用了L-DOPA的氧化反应和化学发光技术，能够快速、准确地测定组织中超氧阴离子自由基的含量。

此外，该方法还具有操作简单、稳定可靠等优点，适用于大规模的实验研究和临床应用。

总之，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。

本文介绍的提取和测定方法能够有效地测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量，为相关研究提供了重要的实验技术支持。