大肠杆菌转化原理

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。

被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理;二、原理一大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态;感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等;细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等;本实验为了把外源DNA重组质粒引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞;在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数;而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生;目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一;主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞;证据有：1发芽的芽孢杆菌容易转化；2大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化；3适量的溶菌酶能提高转化率;2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA 分子能进入细胞;证据是：1蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用；2细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现；3分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞;目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,但是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答;有人根据pBR322 质粒DNA对Ecoli K――12X1776菌株的转化结果,认为：近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在的100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来的水平;二重组DNA 的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新的遗传特性,并从中选出转化子;作为受体的大肠杆菌C600 或DH 5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常是rec基因缺陷型的突变体,同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株;这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解;保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性;制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷rk-mk-rec-同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感Ap;在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素Ap基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新的特性,即Ap 抗性;同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因lacZ,我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因lac Z,使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子;因pUC18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pU C18 DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活;此为初步的抗性筛选;pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个的编码序列;这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能; DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息;在各自独立的情况下,pUC18 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性;但在pUC18 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质;这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补;由α-互补产生的Lac 细菌较易识别,它在生色底物X-gal5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷存在下被IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导形成蓝色菌落;当外源片段T GFβⅠ插入到pUC18 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落;由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开;此为α-互补现象筛选;本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合,使其进入受体细胞;DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附――完整的双链DNA 分子吸附在受体菌表面;2、转入――双链DNA 分子解链,单链DNA 分子进入受体菌,另一链降解;3、自稳――外源质粒DNA 分子在细胞内又复制成双链环状DNA;4、表达――供体基因随同复制子同时复制,并被转录和翻译;对DNA 分子来说,能被转化进受体细胞的比率极低,通常只占DNA 分子的%,改变条件,提高转化率是很有可能的,一些研究表明下列因素可以提高转化率：1受体菌细胞与DNA 分子两者比例在×108 细胞：1毫微克DNA分子左右转化率较好；2DNA 分子与细胞混合时间为1小时最佳；3铺平板条件会影响转化率；4对不同转化菌株热处理效应不一致;除上述因素外,转化试验还注意如下问题：1、连接DNA 反应液与受体细胞混合时,一定保持在冰浴条件下操作,如果温度时高时低,转化效率将极差;2、热处理2 分钟后,要迅速加进1 毫升LB 以使表型表达,延迟加LB,将使转化率迅速降低;3、在平板上涂布细菌时;注容避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械压涂布将会使细胞破裂;影响转化率;三、材料一仪器与器皿恒温振荡器电动沉淀旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温锅恒温普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶刻度保温瓶酒精灯等二大肠杆菌C600 或DH5αrk rec mk三培养基与试剂液体培养基1% %酵母粉%NaCl ;2、100mmol/ L CaCl23.氨苄青霉素溶液50 毫克/毫升连接反应液储液20mg/ml: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃;储液200mg/ml: 在800μl水中溶解200mg IPTG后,用水定容至1ml,用μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃;7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板;8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;四、实验步骤一大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜;2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜约16 小时,必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染;3、用无菌条件下,取过夜培养液1 毫升,接种于新鲜的LB 中100毫升LB/250毫升三角瓶,接种量按菌液浓度而定,一般在1%左右,于恒温振荡器上37℃培养2―3小时;4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照,在751 上测OD550的光密度值,约为― 左右;5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入毫升EP 中应带盖并高压灭菌过,每组2 支;6、带菌液的置于冰上10 分钟,冷却菌液,平衡好,置于台式低速上,3500r/min 离心5 分钟;7、无菌条件下,倒去上清LB,倒斜,让LB 流干,留下沉淀菌体,加入预冷的100mmo l/L CaCl2溶液600微升,用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使其悬浮后,把2支管转为1支,摇匀后于冰浴中放置30分钟;8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速上,3500r/min离心10分钟,小心侧倒掉上清CaCl2,留沉淀菌体;9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液;此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高;10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal 储液和4μlIP TG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;二重组DNA 转化1.取大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液的Eppendorf管,混匀,置冰浴中30 分钟;2.冰浴后,将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温槽内,保温2分种;3.热冲击处理后的细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1 毫升,无抗菌素LB 液,有助于基因表达马上置37℃1 小时,每10 分钟翻转1 次;4.用取毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,共涂布三个培养皿;5.用取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40 ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,作为受体菌对照;6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右,使涂布上的菌液干燥不会流动;然后倒置放于中37℃培养过夜;7.第二天取出培养皿,观察对照平皿和转化平皿菌落情况;对照平皿因受体菌对Am p 敏感,故不能在含Amp的培养基上生长;转化平皿是否有兰色和白色菌落生成如果长出兰色菌落,说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌,但目的基因没有接入载体;如果长出白色菌落,说明目的基因已接入载体,重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落;五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿,讨论转化成败原因.。

简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。

其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。

质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。

2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。

这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。

3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。

这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。

4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。

5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。

这些菌落会在培养基中形成可见的生长。

通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。

这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

大肠杆菌菌落生长的代谢途径研究大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是一种常见的肠道细菌，它在生物学和生物工程领域中广泛使用。

然而，由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，因此胞外菌落的生长环境非常复杂，中间涉及了许多生化反应和代谢途径。

在长期的研究中，人们发现大肠杆菌的菌落生长具有许多特殊的代谢途径，这些代谢途径对于理解菌落生长的基础原理和生物技术的应用都非常重要。

以葡糖代谢途径为例，大肠杆菌可以利用不同的代谢途径将葡糖转换为能量和有机物。

在葡糖分子进入大肠杆菌细胞后，它们被磷酸化为葡萄糖六磷酸（G6P）并分解成两个三碳糖，并在三羧酸循环（TCA循环）中进行有氧代谢。

此外，大肠杆菌还可以通过巴斯德氧化反应将葡糖直接转化为酸和气体，并在少氧环境下进行厌氧代谢，从而产生乳酸、乙醇和丙酸等产物。

此外，大肠杆菌还利用异糖、二糖和三糖等作为碳源来进行生长和代谢。

例如利用蔗糖，蔗糖酶能将蔗糖水解成果糖和葡萄糖，并在内源路最终生成大量的能量物质ATP；利用乳糖，大肠杆菌先进入半乳糖分解通路，分解产生UDP-半乳糖和葡糖醇磷酸，然后再将半乳糖-1-磷酸降解为丙酮酸和乳酸。

在大肠杆菌的代谢途径中还有一些特殊的途径，如烷基磷酸途径、戊糖出路、胆固醇代谢途径等。

烷基磷酸途径是通过燃烧脂肪和肝糖产生的乳酸转换成辅酶A 并生成乙酸和乙酰CoA进而完成燃烧代谢。

戊糖出路是分解果糖和概率糖分解途径之一，通过将果糖醛脱酸缩合成骨架糖代谢产物形成乙酰辅酶A和丙酮酸。

胆固醇代谢途径是关于大肠杆菌能够生产胆固醇，主要条件是大肠杆菌需要在含有预连续的营养结构中生长。

此外，大肠杆菌的代谢途径还可以被分为两个主要的类型：有氧代谢和厌氧代谢。

有氧代谢指的是在富氧环境下，大肠杆菌利用氧气和产生ATP和二氧化碳的化学反应进行代谢生长。

而厌氧代谢指的是在缺氧环境下，大肠杆菌通过产生酸，甲醇和CO2等代谢产物来获得生长所需的能量。

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。

2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。

【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。

未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。

重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。

本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。

2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。

进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。

实验二质粒DNA转化大肠杆菌一、实验目的掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术二、实验原理转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养箱中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型得到表达，然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培养基中。

三、实验仪器及药品仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温培养箱、-70℃冰箱、水浴锅材料：大肠杆菌JM109、pUC19质粒、离心管试剂：LB固体培养基、20mg/mL X-gal、20mg/mL IPTG四、实验内容1、取200μL新制备的感受态细胞，加入DNA 2 μL（50 ng）混匀，冰浴30min，同时用pUC19做两个对照。

1）受体菌对照：200μL感受态细胞+ 2 μL 无菌水2）质粒对照：200μL 0.1mol / L CaCl2溶液+ 2 μL 质粒DNA2、将管放在42℃水浴90s。

3、立即冰浴2 min。

4、每管中加入800μL 的LB液体培养基，培养45min~60min（140rpm）。

5、向两个转化平板中先加入40μL IPTG，再加入40μL X-gal，并用灭过菌的涂布棒将这两样药品涂满平板。

6、然后将适当体积（100μL）转化的感受态细胞涂匀平板。

7、倒置平皿37℃培养12~16 h，出现菌落。

五、实验结果各实验组观察并记录皿内菌落大的生长状况并进行结果分析。

六、思考题如何提高转化率？。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。