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大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
![大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]](https://img.taocdn.com/s1/m/293188f5561252d381eb6e72.png)
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
(二)重组DNA 得转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下得实验就是把重组得DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新得遗传特性,并从中选出转化子。
作为受体得大肠杆菌C600 或DH5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常就是rec基因缺陷型得突变体,同时它们必须就是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷得菌株。
这样外来得DNA分子不会受其限制酶得降解。
保持外来DNA分子在受体细胞中得稳定性。
制备得大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷(rk-mk-re c-)同时此受体细胞还就是氨苄青霉素敏感(Ap)。
在体外构建好得重组分子上具有分解氨苄青霉素(Ap)基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新得特性,即Ap 抗性。
同时载体质粒上具有乳糖操纵得β一半乳糖苷酶基因(l acZ),我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ),使其失去β一半乳糖苷酶活性得原理来选择新构建得重组子。
因pUC18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pUC18 DN A得转化子才能在含有Amp得LB平板上存活下来;而只带有自身环化得外源片段得转化子则不能存活。
此为初步得抗性筛选。
pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)得调控序列与β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸得编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 得阅读框架,不影响其正常功能。
E、coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列得编码信息。
在各自独立得情况下,pUC18 与DH5α编码得β-半乳糖苷酶得片段都没有酶活性。
但在pUC18 与DH 5α融为一体时可形成具有酶活性得蛋白质。
这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段得突变体与带有完整得近操纵基因区段得β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补得现象叫α-互补。
由α-互补产生得Lac 细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
当外源片段TGFβⅠ插入到p UC18 质粒得多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生得氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒得转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
由此可将重组质粒与自身环化得载体DNA 分开。
此为α-互补现象筛选。
本实验就是把外来重组分子与感受态细胞在低温下混合,使其进入受体细胞。
DNA分子转化得原理较复杂:1、吸附――完整得双链DNA 分子吸附在受体菌表面。
2、转入――双链DNA 分子解链,单链DNA 分子进入受体菌,另一链降解。
3、自稳――外源质粒DNA 分子在细胞内又复制成双链环状DNA。
4、表达――供体基因随同复制子同时复制,并被转录与翻译。
对DNA 分子来说,能被转化进受体细胞得比率极低,通常只占DNA 分子得0、01%,改变条件,提高转化率就是很有可能得,一些研究表明下列因素可以提高转化率:(1)受体菌细胞与DNA 分子两者比例在1、6×108 细胞:1毫微克DNA分子(4、3Kb)左右转化率较好;(2)DNA 分子与细胞混合时间为1小时最佳;(3)铺平板条件会影响转化率;(4)对不同转化菌株热处理(效应不一致)。
除上述因素外,转化试验还注意如下问题:1、连接DNA 反应液与受体细胞混合时,一定保持在冰浴条件下操作,如果温度时高时低,转化效率将极差。
2、热处理2 分钟后,要迅速加进1 毫升LB 以使表型表达,延迟加LB,将使转化率迅速降低。
3、在平板上涂布细菌时。
注容避免反复来回涂布,因为感受态细菌得细胞壁有了变化,过多得机械压涂布将会使细胞破裂。
影响转化率。
三、材料(一)仪器与器皿恒温振荡器分光光度计电动沉淀离心机旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温水浴锅恒温摇床普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶试管刻度离心管保温瓶酒精灯等(二)菌种大肠杆菌C600 或DH5α(rk rec mk)(三)培养基与试剂1、LB 液体培养基(1%蛋白胨0、5%酵母粉0、5%NaCl pH7、5。
)2、100mmol/ L CaCl23、氨苄青霉素溶液(50 毫克/毫升)4、DNA 连接反应液5、X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml得储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。
6、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0、22μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃。
7、含Amp 得LB 固体培养基:将配好得LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入A mp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板。
8、含X-gal 与IPTG 得筛选培养基:在事先制备好得含50μg/ml Amp得LB 平板表面加4 0ml X-gal储液与4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面得液体完全被吸收,备用。
四、实验步骤(一)大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜。
2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB试管中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜(约16 小时),必要时在显微镜下镜检菌细胞就是否形态一致,有无杂菌污染。
3、用移液管无菌条件下,取过夜培养液1 毫升,接种于新鲜得LB 中(100毫升LB/250毫升三角瓶,接种量按菌液浓度而定,一般在1%左右),于恒温振荡器上37℃培养2―3 小时。
4、取1 毫升培养液以未接种得LB 作空白对照,在751 分光光度计上测OD550得光密度值,约为0、2―0、5 左右。
5、无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1、5毫升EP 离心管中(离心管应带盖并高压灭菌过),每组2 支。
6、带菌液得离心管置于冰上10 分钟,冷却菌液,平衡好,置于台式低速离心机上,3500r/min 离心5 分钟。
7、无菌条件下,倒去上清LB,倒斜离心管,让LB 流干,留下沉淀菌体,加入预冷得100mmol/L CaCl2溶液600微升,用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使其悬浮后,把2支管转为1支,摇匀后于冰浴中放置30分钟。
8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速离心机上,3500r/min离心10分钟,小心侧倒掉上清CaCl2,留沉淀菌体。
9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2得溶液中,置于冰上作为转化得受体菌液。
此制备得感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高。
10、在事先制备好得含50μg/ml Amp得LB 平板表面加40ml X-gal 储液与4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面得液体完全被吸收,备用。
(二)重组DNA 转化1、取0、2ml 大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液得Eppendorf管,混匀,置冰浴中30 分钟。
2、冰浴后,将正在转化反应得细胞悬浮液加入已调好42℃得得恒温水浴槽内,保温2分种。
3、热冲击处理后得细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1 毫升,(无抗菌素LB 液,有助于基因表达)马上置37℃水浴1 小时,每10 分钟翻转1 次。
4、用移液器取0、1 毫升得转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液与4μl IP TG 储液LB 固体平皿上,共涂布三个培养皿。
5、用移液器取未经转化得受体大肠杆菌感受态菌液0、1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40ml X-gal 储液与4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,作为受体菌对照。
6、将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右,使涂布上得菌液干燥不会流动。
然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。
7、第二天取出培养皿,观察对照平皿与转化平皿菌落情况。
对照平皿因受体菌对Amp 敏感,故不能在含Amp得培养基上生长。
转化平皿就是否有兰色与白色菌落生成？如果长出兰色菌落,说明自连得载体pUC18质粒已转入受体菌,但目得基因没有接入载体。
如果长出白色菌落,说明目得基因已接入载体,重组质粒得转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 与ITPG 存在得生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
五、结果与讨论比较对照平皿与转化平皿,讨论转化成败原因、。
