OPTI MEM进行贴壁细胞培养的实验方法

转染（24-well）步骤1、贴壁细胞，0.5×105/500μl无抗生素培养基2、0.8μgDNA加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)3、2μl Lipofctoomine TM2000加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)，室温5min4、混合后室温20min共100μl5、每孔加100μl，混匀6、37℃培养18-48h，4-6h是更换培养基型号总体积DNA Lipo200096-well 100μl 0.2μg 0.5μl24-well 500μl 0.8μg 2μl6-well 2ml 4.0μg 10μl60-mm 5ml 8.0μg 20μl10-cm 15ml 24μg 60μlWestern Blot步骤一、蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取（Monolayer adherent cells）:1、倒掉营养液，用冰预冷的PBS洗三次，弃净PBS后把培养皿置于冰上（期间标记EP管，用冰）2、1ml三去污裂解也加7μl PMSF（苯甲基磺酸氟）、1μl aprotinin(抑肽酶)、1μl leupetin（亮氨酸）、1μl pepstain(胃酶抑素)摇匀置于冰上。

也可以用冰冷PBS转移至EP管离心后再裂解，可操作性更强。

用量：6孔板每孔25μl，60mm2平皿70μl。

用过的scraper先用75%乙醇洗，再用超纯水洗3、在冰上用塑料细胞刮刮下贴壁细胞，用加样器吸至EP管中，4℃冰箱中震荡15分钟4、于4℃下12000rpm离心30min（提前开离心机预冷）5、将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中放于-20℃保存（2）组织中总蛋白的提取1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。

然后置于冰上。

裂解完一管先用75%乙醇洗，再用超纯水洗，最后用吸水纸吸干。

各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。

将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。

使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。

2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。

4. 室温孵育20分钟。

5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。

6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。

细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。

3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。

室温放置20分钟。

5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。

此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。

在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。

贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。

第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。

第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。

第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。

第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。

以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。

同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。

贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。

贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。

最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。

总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。

一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。

以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。

（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。

三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。

转染率很高。

以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。

这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。

有文献说传代不要超过17代。

我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。

贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。

液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。

吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。

二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。

5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。

6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。

一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。

10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。

三、冻存1.把原有培养基吸掉。

2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。

4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。

5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。

7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。

2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。

3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。

二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。

细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。

细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。

三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。

2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。

2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。

3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。

2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。

5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。

2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。

五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。

2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。

2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。

3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。

贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。

1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。

1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。

第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。

2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。

2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。

第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。

3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。

3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。

第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。

4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。

可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。

4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。

第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。

注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。

5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。

5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。

注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。

2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。

3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。

4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。

5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。

上海opti-mem转染试剂原理上海opti-mem转染试剂是一种常用于细胞转染实验中的试剂，它可以帮助研究人员将外源DNA分子有效地引入到目标细胞中。

该试剂采用了一种特殊的化学方法，通过改变细胞膜的通透性，使得外源DNA能够穿过细胞膜进入到细胞质中。

下面是关于上海opti-mem转染试剂原理的详细介绍：1. 上海opti-mem转染试剂的成分：上海opti-mem转染试剂主要由两部分组成：脂质体和DNA复合物。

脂质体是由一种正离子表面活性剂（如聚乙烯亚胺或脂肪酸酯化合物）和胆固醇等组分构成的，它们能够与DNA形成可逆的复合物。

DNA复合物则是由目标DNA分子与脂质体形成的复合物，通过这种复合物，外源DNA能够进入到细胞内。

2. 上海opti-mem转染试剂的作用机制：-第一步，脂质体与DNA复合物的形成：脂质体与目标DNA形成可逆的复合物，这个过程主要是通过静电相互作用来进行的。

脂质体中的正带电离子通过与DNA的负带电离子相互作用，使得DNA与脂质体相结合。

-第二步，脂质体与细胞膜的结合：通过与细胞膜上的负带电成分相互作用，脂质体能够与细胞膜上的带电成分相结合。

这种结合主要是通过静电相互作用来实现的。

-第三步，细胞膜的改变：脂质体与细胞膜结合后，会改变细胞膜的组织结构和特性，使得细胞膜的通透性增加。

这个过程中，细胞膜上的磷脂分子会发生重新排列和重新组装，从而改变了细胞膜的通透性。

-第四步，外源DNA的进入：由于细胞膜的通透性增加，外源DNA能够通过细胞膜进入到细胞质中。

一旦进入到细胞质中，外源DNA就能与细胞内的各种分子（如细胞核、细胞器等）相结合，从而实现转染。

综上所述，上海opti-mem转染试剂通过改变细胞膜的通透性，使得外源DNA能够进入到细胞中，并与细胞内的各种分子相结合。

这种转染试剂具有简单、高效、可靠等特点，被广泛应用于各种细胞转染实验中。

支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。

实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。

（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。