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实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
PH0302|超低分子量蛋白Marker II(3.4-100kD)Ultra Low Molecular Weight Protein Marker货号：PH0302规格：☐10T（50ul）保存：Store@-20℃◆产品简介本产品包含5种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为3.4kD-100kD。
可以用来判断SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。
◆使用说明第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品为即用型，融化后既能使用，不能95℃加热处理。
一.制胶：I配制分离胶1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。
2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。
4．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
表一（一块0.75mm mini胶用量）分离胶浓缩胶18％T,5%C/6.0ml5％T,3.3%C/2ml 40%PAA（19:1） 2.7ml/40%PAA(29:1)/0.25ml4×凝胶缓冲液 1.5ml0.5ml乙二醇（电泳级） 1.8ml/ddH2O/ 1.25ml10％APS50-65μl20μlTEMED6μl2μl注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
II配制浓缩胶去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。
1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
2．加入10%过硫酸铵和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
蛋⽩Marker说明书PageRuler Prestained Protein LadderSM0671A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at10 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Prestained Proteis a mixture of ten (10) blue-, orange- and green-srecombinant proteins (10 to 170kDa) for use as sizstandards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)Western blotting.This prestained protein MW marker is designed fomonitoring the progress of SDS-polyacrylamide geelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onylon and nitrocellulose membranes, and for estimapproximate size of separated proteins that have b visible with gel stains or Western blot detection reagents. The ladder contains one orange refer at 70kDa and one green band at 10kDa.Highlights:Size range– 10 proteins spanning 10 to 170kDaReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingTwo reference bands– orange at 70kDa and green at 10kDaMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 1 1mM NaN3 and 33% glycerol. Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSm1841The Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad RangeProtein Ladder is a 4-color protein standard containing 10prestained recombinant prokaryotic proteins (10 to 260kDa)for use as size standards in gel electrophoresis and Westernblotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. Four different chromophores (blue, orange, green, pink) are bound to the different component proteins, producing a brightly colored ladder with an easy-to-remember pattern.Highlights:Size range– 10 proteins spanning 10 to 260kDaMulticolor– four different colors for unambiguous band-size assignmentReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boilSharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:Sm1811The Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained ProteinLadder is a mixture of nine (9) blue-, orange- andgreen-stained recombinant proteins (10 to 250kDa) for useas size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)and Western blotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. A blue chromophore is bound to all proteins, except proteins of two reference bands of 70kDa and 25kDa that are colored with an orange dye and one green reference band of 10kDa. PageRuler Plus Prestained Protein Ladder is ready to use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required before loading onto a gel.Highlights:Size range– nine proteins spanning 10 to 250kDaReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boilSharp bands– color-coded bands of similar intesity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingBright reference bands– orange at 70 and 25kDa, and green at 10kDaMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:。
DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。
2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。
3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。
4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。
将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。
9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。
DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。
准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。
2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。
3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。
4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。
5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。
DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。
蛋白marker标记颜色方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白marker标记颜色方法在生物科学研究中，标记蛋白是非常常见的实验技术之一。
蛋白marker的标记可以帮助研究人员在实验中追踪和定位蛋白，从而更好地理解蛋白的功能和相互作用。
而标记蛋白的颜色选择也是非常重要的，不同颜色的标记能够帮助实验者在实验过程中更清晰地识别和分析样品。
本文将介绍一些常用的蛋白marker标记颜色方法，希望能够帮助读者更好地进行蛋白标记实验。
一、荧光标记荧光标记是蛋白标记颜色中最常用的方法之一。
通过将蛋白与荧光物质结合，可以在光学显微镜下直接观察到蛋白标记的颜色。
常用的荧光标记包括FITC（荧光异硫氰酸酯），TRITC（罗丹明异硫氰酸酯）和Cy5（Cyanine5）。
这些荧光物质在实验中常用于免疫荧光染色、融合蛋白标记等实验中。
荧光标记的优势是信号强度高、灵敏度高且不受环境影响，适用于单细胞和组织的标记。
在实验中，荧光标记的颜色可以根据荧光物质的不同而有所区分。
比如，FITC标记的蛋白呈现绿色，TRITC标记呈现橙红色，Cy5标记呈现红色。
实验者可以根据实验需要选择不同的荧光标记物质，并通过显微镜观察到标记蛋白的颜色。
二、生物素标记生物素标记是一种基于生物素-亲和素相互作用的蛋白标记方法。
生物素是一种维生素H成分，具有与亲和素结合的特性。
在实验中，生物素可以与生物素素结合并形成稳定的结合物，从而实现蛋白的标记。
生物素标记的颜色在实验中常表现为紫色，实验者可以通过观察颜色变化来判断蛋白是否标记成功。
生物素标记的优势是其结合力强、稳定性高，适用于长时间的实验操作。
另外，生物素标记也可以用于有机溶剂、高温、酸碱环境等多种条件下的蛋白标记。
因此，在一些特殊实验条件下，生物素标记是一种非常理想的标记方法。
三、酶标记酶标记是另一种常用的蛋白标记方法。
通过将蛋白与酶结合，可以在实验中通过酶的催化作用来识别蛋白的存在。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
1PH0304|宽分子量蛋白Marker (10-200kD)Catalog No ：PH0304Size ：☐20T (100ul)Storage ：Store@-20℃
◆简介
本产品包含14种蛋白质混合物，分子量范围为10kD-200kD，经过SDS-PAGE 电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到14条带，可以用来判断SDS-PAGE 电泳后蛋白质的分子量。
◆保存
Store at -20℃；有效期12个月
◆使用参考
a 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用。
b 取出分装后的Marker，常温融化，轻柔彻底混匀，管底不能见沉淀物。
注：此Marker 为即用型，溶化后直接上样，不要95℃处理！
c 上样量根据胶的厚度和梳子的宽度确定。
一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。
注：使用银染时，由于灵敏度高于考马斯亮蓝染色方法，可以适当降低Marker 上样量。
d 电泳结束后，染色，观察结果。
电泳结果如出现带型缺失现象或样品聚集在分离胶上沿，可在Marker 中加入终浓度为100mM 的DTT 后再上样。
12%分离胶电泳示意图
梳子尺寸：0.75mm*5mm
上样量：5ul。
成像系统和荧光染料的改进为科学家们提供了更有力的工具，使他们可以利用蛋白质免疫印迹技术挖掘更多数据。
荧光蛋白质免疫印迹提供准确定量的结果和稳定的信号，并且能够在单张印迹膜上检测多个目标蛋白，这就是所说的多重成像检测。
多重检测有助于使研究更高和更多产，例如，可以同时观察到目标蛋白和上样内参蛋白（图1），区分具有相似分子量的蛋白质（图2），并评价复杂的生物学通路（图3）。
在多重检测中，同时检测2种目标蛋白称为二重实验，同时检测3种目标蛋白称为三重实验，以此类推。
使用Invitrogen™ iBright™ FL1500成像系统并进行适当实验设计，最多可进行4重荧光蛋白质免疫印迹检测（图4）。
在本指南中，我们将分享成功进行多重荧光蛋白质免疫印迹检测的最佳实践和技巧。
开始前的重要提示在开始多重检测实验之前，请考虑以下几点以尽量减少背景荧光：• 为了消除背景荧光的主要来源，需要使用具有低自发荧光的转印膜，例如硝酸纤维素膜或低荧光PVDF膜（货号22860）。
• 处理膜时必须佩戴手套并使用清洁的圆头镊子，尽量避免膜上出现可能会增强背景荧光并造成荧光伪迹的污染和刮痕。
• 使用高质量的已过滤缓冲液（例如，Thermo Scientific™Blocker™ FL荧光封闭缓冲液（货号37565））。
封闭和洗涤缓冲液中的微粒和污染物可能会遗留在膜上并产生荧光伪迹。
另外，在封闭去污步骤中谨慎使用去污剂，因为普通的去污剂会自发荧光，可能增强非特异性背景。
• 样品缓冲液可能含有自发荧光的组分（如溴酚蓝），这可能会增强背景。
我们建议使用荧光相容性样品缓冲液（例如，Invitrogen™荧光兼容型上样缓冲液，货号LC2570）。
• 如果蛋白marker中含有用荧光基团标记的蛋白质，或者在某些波长下会发出荧光的化合物染色的蛋白质，在凝胶电泳中则可减少上样量。
过量上样可能会遮挡邻近泳道中的信号。
建议使用Invitrogen™ iBright™预染蛋白质marker（货号LC5615）进行多重荧光检测。
Western blot操作流程1. 样品的准备a 收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对丁某些特定的业细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些业细胞组份蛋白，也可以使用相应的蛋白抽提试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对丁一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
b样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2>< 5X 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5冲勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5邓勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的配置100C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
如果不立即电泳，样品可放置丁-20 C或者-80 C保存。
2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）a准备SDS-PAGE凝胶[1] .按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。
（注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗一遍，晾干）[2] .装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。
[3] .根据表1确定凝胶浓度体积，按表3配制分离胶溶液。
按表中成分顺序加入烧杯配制。
[4] .小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,灌到足够高度。
注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm,即梳齿长再加1 cm。
）[5] .轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。
[6] .凝胶充分聚合。
时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面问有一活晰的折光线。
