浅析食品微生物检验中ATP发光法的应用
摘要：本文就atp生物发光法的检测原理、检测步骤、特点、检测的影响因素及在食品工业中的应用进行了综述，并提出了目前atp生物发光法检测中存在的问题。
关键词：atp 生物发光法；荧光素；提取剂；温度；检验
1 atp 的理化性质
1.1 atp广泛存在于各种活的生物体中,活的菌体中也含有atp。细菌死亡后,在细胞内酶的作用下,atp将很快被分解掉。atp是高能磷酸化合物的典型代表。atp 是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸，其分子结构式如图1所示。图1 atp分子结构式
1.2 atp有两个高能磷酸键，一个低能磷酸键。每个高能磷酸键水解时，可产生30．54kj／mol的能量。atp是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内，如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的ph、mg2+浓度等的影响。
2 atp生物发光法检测的原理及一般步骤
2.1 atp普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，atp很快被分解掉。因此，测定样品中的atp浓度，即可推算出活菌数。atp生物发光技术产生于20世纪70 年代中期。1983年，moyer 等最早提出细胞内源性atp的含量可以反映细胞的活性和活细胞
的数量。同年gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。mcelroy[最先引入荧光素酶．atp检测法，其反应机理为：在mg2+存在下，萤火虫荧光素酶以d-荧光素酶、atp、o2为底物，将化学能转化为
光d-荧光素+atp+o2 oxy-荧光素+amp+ppi+h2o能，发出光量子，其发光
强度(i)与atp浓度(catp)符合下列函数关系。
式中，imax为最大发光强度；km为1×1o-4。由上式可知，当catp远小于km时，
i正比于样品中的catp。因此可通过测定发光体系的i来定量atp 浓度。
2.2 每个细胞的atp含量大致是一定的，如大肠杆菌是1．4×10-18mol/细胞，乳酸菌是1．9×10-18mol/细胞，则由此可以推算出细菌数量。但由于实际检测中除含有细菌外，还含有酵母等其他微生物，而酵母菌中atp的含量通常是细菌中atp 含量的100倍左右。因此，若同时又全部换算成酵母菌的活菌数量，则样品中活菌数应介于二者之间。
2.3 此外，曾有学者以生物量c／atp来推算生物量。karl等研究了浮游植物的生物量与atp含量之间的关系，发现单细胞微生物的生物量c／atp的平均比值为 250，而多细胞有机物的生物量c ／atp则小于1o0。还有学者预计通过测定atp／ cfu的大小来预测样品中所含菌种类别，若atp／cfu较小，则样品中可能主要含有
形态较小的g-细菌或孢子；若atp／cfu较大，则样品中可能主要含有酵母菌或形态较大的g+细菌。
2.4 atp生物发光法的检测步骤大体包括：取样、样品atp的萃取、添加荧光素．荧光素酶、测定生物发光量、求出atp浓度和活菌数。通常，样品未经处理是不能测定atp的。测定时需先将样品与atp提取剂混合，使细胞膜和细胞壁溶解，释放出atp。atp 提取剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，提取出的atp再与荧光素-荧光素酶生物发光剂作用，用发光检测仪测定atp与发光剂反应的生物发光量。通过预先测定的atp标准曲线，得出活菌的总atp量，即可得出细菌总数。
3 atp生物发光法的特点及应用
3.1 atp 生物发光法的优点主要是快速、简便、重现性好；而由于其要求样品中细菌浓度最低不少于 1000 个／ml，使得灵敏度有时达不到卫生学要求。此外， atp 生物发光法不能区分微生物atp 与非微生物 atp；并且由于食品本身、atp 提取剂等含有离子，某些离子又会对 atp 的测定造成干扰、抑制发光作用等。
3.2 atp生物发光法的应用范围十分广泛，现己应用于食品工业的众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。研究表明，atp生物发光法与标准的细菌培养菌落计数法相比，二者具有良好的相关性(r=0．98)。此外，atp 生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。实验表明，atp生物发光法与传统的琼脂平板
法均具有高度的相关性。
3.3 食品生产环境的清洁度检测是haccp的重要内容。haccp是指在食品生产和流通的整个过程中，对可能发生危害食品安全之处进行分析，确定出应重点进行卫生管理之处，并在此处设定卫生管理标准，经常进行监测，记录下检测结果，以防止危害健康的事件发生。以往食品生产环境的清洁度管理多采用棉拭取样与平板培养法共用的方法来检测表面附着的微生物，这样就使得检测时间长、检测结果滞后，因而不能满足haccp管理系统的要求。而食物残渣是食品生产环境的主要污染物质，且各种食品中均含有atp，atp耐热性较强。因此，采用atp生物发光法可快速、简便地检测出食品生产环境的清洁度。这样，atp生物发光法就十分适合haccp系统的清洁度检测。
4 结论与展望
4.1 atp生物发光法具有简便、快速、价廉等优点,作为食品生产和流通过程中的微生物检测和清洁度检测的一种新方法,近年来,
在国外倍受推崇,在美、日等国已广泛应用,并已有专用检测仪器。但是atp生物发光法也会受到微生物数量、非微生物atp、atp
提取剂、ph、温度、色素等诸多因素的影响。在实际应用中，应设法将这些干扰因素减少到最低。
4.2 目前的atp生物发光法应主要围绕以下进行展开：
4.2.1微生物细胞中atp的含量与菌的种类、大小及细胞生长所处的周期有关，因此，还需对细菌等微生物进行分级分离工作，
以确定菌的种类等。
4.2.2在发光体系中，荧光素、荧光素酶、缓冲液、样品提取液等“量”的分配是否能进一步优化。可以尝试用sas软件进行试验优化设计，以期得到优化后的试验条件；
4.2.3发光增强剂、发光抑制剂在生物发光反应中的具体作用机理，如何减少甚至消除抑制剂对发光反应的不良影响；
4.2.4发光检测仪是否受波长、电压等影响，具体影响如何；
4.2.5荧光素、荧光素酶种类的选择与优化；
4.2.6发光检测仪的灵敏度的进一步提高，重复性的保证等。现在，已涌现将免疫磁分离技术应用于atp生物发光法，二者结合使灵敏度大大提高。随着对此种方法不断改进和完善,atp生物发光法可望发展成为一种较为理想的微生物检测方法而得到更广泛的应用。
5 参考文献：
5.1于文彬临床微生物学的重要意义及其发展的几个特点[j]，2002年室间质评总结资料汇编,2002。
5.2张菊梅，吴清平，李程思等，生物发光法微生物快速检测试剂的性质及其影响因素研究[j]，微生物学通报，2006。
