植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵

毕赤酵母高密度发酵产植酸酶的研究
李茹;陈鹏;梁运祥
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2004(035)006
【摘要】以基因工程菌Pichia pastoris为实验菌株,采用液态发酵方式生产植酸酶,对高效产酶的生产条件做了初步研究.结果表明:最有利于产酶的条件是:甘油4%、硫酸铵1%、接种量1%、KH2PO4含量0.8%,初始pH对产酶有显著影响.
【总页数】3页(P500-502)
【作者】李茹;陈鹏;梁运祥
【作者单位】黄冈师范学院生物系,湖北黄冈,438000;黄冈师范学院生物系,湖北黄冈,438000;华中农业大学生科院
【正文语种】中文
【中图分类】TS202.3
【相关文献】
1.毕赤酵母基因工程菌高密度发酵产纳豆激酶条件研究 [J], 闫达中;许芳;杨艳燕
2.毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究 [J], 徐明;付会兵;刘鹏;钱建阳;求赵明;王浩均;柳志强;郑裕国
3.产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究 [J], 曹丁; 李学优; 肖宏艳; 昝继清
4.重组毕赤酵母产β-甘露聚糖酶的高密度发酵研究 [J], 杜少平;胡海艳;甘祥武;黄秀敏;叶俊豪
5.重组毕赤酵母产β-甘露聚糖酶的高密度发酵研究 [J], 杜少平;胡海艳;甘祥武;黄秀敏;叶俊豪
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重组植酸酶appA-2 QN在毕赤酵母中的高效表达宋玛丽;王茜;杜军;赵峰梅;梁爱华【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】对来源于大肠杆菌的植酸酶基因 appA进行突变获得植酸酶基因突变体appA-2QN，利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后，该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。

为提高该植酸酶的表达量，降低植酸酶的生产成本，对表达该酶的重组酵母菌 GS115/appA-2QN进行了高密度发酵研究，通过控制发酵过程中碳源（甘油）的添加使得菌体生长达到一定密度，从而实现高效表达。

在诱导蛋白质表达阶段，发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量，利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。

结果表明，在5 L 发酵罐中进行高密度发酵147 h 后，菌体浓度OD600nm达到313，通过将甲醇浓度控制在2.5%左右，经过诱导102 h后，蛋白达到了较高的表达量，为7.06 g/L，酶活性（发酵效价）为2.03×105 U/mL。

结果表明，通过高密度发酵提高了产植酸酶 appA-2QN 的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量，揭示该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。

【总页数】4页(P55-58)【作者】宋玛丽;王茜;杜军;赵峰梅;梁爱华【作者单位】山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 030006;山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 030006;山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 030006;山西省生物研究所，山西太原 030006;山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.大肠杆菌K12植酸酶热稳定性突变体在毕赤酵母中的高效表达和性质研究 [J], 周玉玲;邹由;付玲;江维;战飞翔;康立新;马向东;马立新2.密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达 [J], 黄光瑞;田丽春;黄生平;蒋思婧;马立新3.来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达 [J], 黄火清;罗会颖;柏映国;王亚茹;姚斌;孟昆;袁铁铮;杨培龙4.大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达 [J], 高娇;郑学云;林影;梁书利5.植酸酶基因的多点突变及在毕赤酵母中的高效表达 [J], 许钦坤;王红宁;李洪淼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３１卷第５期２０１８年１０月出版Ｖｏｌ.３１Ｎｏ.５Ｏｃｔ.２０１８ＤＯＩ:１０.３９７６/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣４０２６.２０１８.０５.００８ʌ生物传感器ɔ收稿日期:２０１８￣０５￣３０基金项目:山东省重点研发计划(２０１６ＺＤＪＳ０７Ａ２０)作者简介:赵凯(１９８７－)ꎬ男ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为微生物发酵ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｏｋ＠ｖｌａｎｄｇｒｏｕｐ.ｃｏｍ不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响赵凯ꎬ葛菁华ꎬ王海(青岛蔚蓝生物集团有限公司ꎬ山东青岛２６６１０１)摘要:不同比生长速率控制条件下毕赤酵母代谢流流向不同ꎬ从而导致产酶量的不同ꎮ为了得到毕赤酵母发酵生产植酸酶的最适比生长速率ꎬ对毕赤酵母工程菌５０Ｌ发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究ꎮ结果表明ꎬ通过调节甲醇的流加速度ꎬ控制菌体比生长速率为０.０２ｈ－１ꎬ发酵结束时ꎬ植酸酶酶活１７４４５Ｕ/ｍＬꎬ比对照提高６９.７％ꎬ该比生长速率对发酵生产植酸酶最有利ꎮ关键词:毕赤酵母ꎻ植酸酶ꎻ比生长速率ꎻ发酵优化中图分类号:Ｑ９３６㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０１８)０５￣００４３￣０５ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｎｐｈｙｔａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＺＨＡＯＫａｉꎬＧＥＪｉｎｇ￣ｈｕａꎬＷＡＮＧＨａｉ(ＱｉｎｇｄａｏＶｌａｎｄＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０１ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＤｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｌｅａｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘｅｓｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓꎬｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｏｂｔａｉｎｏｐｔｉｍｕｍｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｈｙｔａｓｅｂｙＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓꎬｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｈｙｔａｓｅｉｎ５０Ｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔａｎｋｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｗａｓａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ０.０２ｈ－１ｂｙｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｈｅｆｌｏｗｏｆｍｅｔｈａｎｏｌꎬｂｙｔｈｅｅｎｄｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬｔｈｅｐｈｙｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｇｏｔｔｏｂｅ１７４４５Ｕ/ｍＬꎬｗｉｔｈ６９.７％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ.Ｉｔｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｉｓｔｈｅｍｏｓｔｆａｖｏｒａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｈｙｔａｓｅｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓꎻｐｈｙｔａｓｅꎻｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅꎻｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀植酸酶作为一种高效的饲料添加剂ꎬ在动物体内可以帮助其降解植酸盐ꎬ改善磷和其他养分的消化吸收ꎬ减少养分排泄ꎬ提高磷的利用率ꎬ增加养殖户的经济效益ꎬ同时对降低植酸磷对环境的污染有重要作用ꎮ目前ꎬ养殖业对植酸酶的需求越来越大ꎬ同时更加关注其成本ꎮ因此ꎬ提高植酸酶表达量ꎬ降低发酵成本成为植酸酶研究㊁生产的当务之急ꎮ毕赤酵母植酸酶发酵工艺优化的研究已有很多报道ꎮ李洪淼等[１]对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了实验ꎬ并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究ꎮ黄魁英等[２]对植酸酶毕赤酵母基因工４４山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年程菌ＰＥＹ￣２的发酵条件进行了研究ꎮ郭美锦等[３]对重组毕赤酵母表达工程植酸酶过渡相参数进行了分析研究ꎮ闵兆升等[４]采用单因素试验和正交试验考察了不同工艺条件对毕赤酵母工程菌Ｈ３１１产植酸酶的影响ꎮ王兴吉等[５]对毕赤酵母Ｈ工程菌３０Ｌ发酵产植酸酶的发酵条件及该酶的热稳定性进行了研究ꎮ比生长速率对微生物发酵影响的研究也有报道ꎮ任海涛等[６]在已建立的毕氏酵母发酵过程结构模型基础上ꎬ进行了甲醇流加阶段恒定比生长速率控制研究ꎬ实验结果表明在比生长速率均值相等的情况下ꎬ恒定比生长速率进料策略较之恒速进料策略蛋白产量更高ꎮ魏春等[７]对毕赤酵母胞内表达重组鲈鱼生长激素的发酵罐生产进行了研究ꎬ建立了指数流加甲醇的策略并考察了不同比生长速率对重组鲈鱼生长激素生产的影响ꎮ槐强强等[８]通过在低细胞浓度下启动甲醇诱导㊁优化碳/能量代谢模式促进毕赤酵母表达甜味蛋白ꎮ刘晓明等[９]对影响毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的因素和调控措施(如基因工程菌㊁培养基㊁生长阶段菌体密度及比生长速率)ꎬ以及发酵过程中参数调控和毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的应用等进行了综述分析ꎮ赵林水等[１０]利用重组毕赤酵母在７Ｌ发酵罐中进行分批补料高密度发酵ꎬ考察了不同ＮＨ＋４质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响ꎮ在毕赤酵母生产植酸酶的过程中ꎬ发酵条件是影响植酸酶表达量的主要因素ꎬ而发酵条件的优化主要包括培养基的组成㊁温度㊁ｐＨ㊁溶氧量(ＤＯ)㊁补料流加策略等ꎮ甲醇作为发酵过程中的碳源和诱导剂ꎬ其补加策略㊁用量及诱导时间都直接影响菌体的生长与外源蛋白的表达ꎮＤＯ控制甲醇流加速率是目前最常见的方法ꎬ然而在毕赤酵母发酵过程中ꎬ该方法并不是一种有效的方法ꎮ实验表明ꎬ当甲醇的浓度达到抑制菌体生长时ꎬＤＯ上升ꎬ从而形成一种假象ꎬ这时甲醇的流加速率会随着ＤＯ的上升而逐渐增大ꎬ因此甲醇的浓度也会增大ꎬ这样会严重地抑制菌体生长ꎬ造成中毒现象[１１]ꎮ目前ꎬ通过比生长速率控制甲醇流加对毕赤酵母发酵生产植酸酶方面的研究未见报道ꎮ本文针对不同比生长速率控制甲醇流加对植酸酶发酵的影响进行相关研究ꎬ以期得到最适的比生长速率范围ꎬ用来指导甲醇补料ꎬ提高植酸酶表达量ꎮ１㊀研究方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀菌株重组毕赤酵母基因工程菌(Ｍｕｔ＋)ꎬ由本公司自行构建ꎬ分泌表达植酸酶ꎮ１.１.２㊀培养基种子培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖(ＹＰＤ)培养基ꎬ发酵培养基为基础盐(ＢＳＭ)培养基(用葡萄糖替换甘油)ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀种子培养将保藏菌种接种到５０ｍＬ的ＹＰＤ培养基中培养１８~２４ｈꎬ再按照１０％接种量接种ＹＰＤ培养基扩培１６~２４ｈꎬ然后按照８％接种量接入发酵罐ＢＳＭ培养基中发酵培养ꎮ１.２.２㊀发酵控制流加氨水控制ｐＨ４.５ꎬ底糖耗尽后通过流加含１２ｍＬ/Ｌ微量盐(ＰＴＭ１)培养基的６０％的葡萄糖增加湿重ꎬ控制相同湿重(１８０ｇ/Ｌ左右)开始诱导ꎬ根据实验需求和测量的湿重控制不同比生长速率(μ)０.０１ｈ－１㊁０.０１５ｈ－１㊁０.０２ｈ－１进行相应的甲醇补料诱导植酸酶表达ꎮ每隔８ｈ或１６ｈ取样测湿重ꎬ然后调节甲醇补料量为湿重与比生长速率乘积ꎮ１.２.３㊀分析方法细胞湿重测定:１０ｍＬ发酵液１００００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后弃上清称重ꎻ植酸酶酶活测定:ＧＢ/Ｔ１８６３４ ２００９饲用植酸酶活性的测定分光光度法[１２]ꎮ第５期赵凯ꎬ等:不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响２㊀结果与讨论２.１㊀对照实验发酵液底料中含有３０ｇ/Ｌ葡萄糖ꎬ葡萄糖耗尽之后ＤＯ回升ꎬ此时开始流加６０％的葡萄糖直至诱导所需湿重１８０ｇ/Ｌ(大约发酵时间２４ｈ时)ꎬ之后停止流加葡萄糖ꎬ饥饿３０ｍｉｎ左右ꎬ开始流加甲醇诱导产酶ꎮ对照组甲醇流加策略参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ毕赤酵母发酵手册[１３]进行控制ꎬ速度从１ｇ/(Ｌ ｈ)开始ꎬ每两小时提高０.５ｇ/(Ｌ ｈ)ꎬ直到甲醇流加速度为４.５ｇ/(Ｌ ｈ)时ꎬ停止继续提高ꎬ并以该流速至发酵结束ꎮ由图１可知ꎬ发酵４０ｈ时(大约诱导后１５ｈ左右)ꎬ湿重１８６ｇ/Ｌꎬ酶活６９１Ｕ/ｍＬꎬ随后酶活和湿重随发酵时间增加ꎬ发酵１４４ｈ时湿重出现轻微下降ꎬ最后两个取样点酶活基本相同ꎬ至发酵１６８ｈ时下罐ꎬ此时湿重４０８ｇ/Ｌꎬ酶活１０２８２Ｕ/ｍＬꎮ图１㊀对照酶活湿重曲线Ｆｉｇ.１㊀Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｗｅｔｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ２.２㊀比生长速率为０.０１ｈ－１时的产酶状况甲醇诱导产酶之前的过程同２.１ꎮ甲醇流加速度从１ｇ/(Ｌ ｈ)开始ꎬ按照０.０１ｈ－１乘以相应的湿重(每８ｈ或１６ｈ取样测湿重ꎬ然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料ꎮ由图２可知ꎬ发酵４０ｈ时ꎬ湿重１９２ｇ/Ｌꎬ酶活５８３Ｕ/ｍＬꎬ随后酶活和湿重随发酵时间增加ꎬ酶活１６８ｈ时出现轻微下降ꎬ至发酵１６８ｈ时下罐ꎬ此时湿重４５７ｇ/Ｌꎬ酶活１１７６３Ｕ/ｍＬꎮ以０.０１ｈ－１的比生长速率进行甲醇流加ꎬ发酵最终消耗甲醇５.３Ｌꎬ而对照组甲醇消耗６.２Ｌꎬ尽管甲醇消耗比对照少１４.５％ꎬ但是酶活却比对照高１４.４％ꎮ图２㊀比生长速率０.０１ｈ－１时酶活湿重曲线Ｆｉｇ.２㊀Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｗｅｔｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔｃｕｒｖｅａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ０.０１ｈ－１２.３㊀比生长速率为０.０１５ｈ－１时的产酶状况甲醇诱导产酶之前的过程同２.１ꎮ甲醇流加速度从１ｇ/(Ｌ ｈ)开始ꎬ按照０.０１５ｈ－１乘以相应的湿重(每５４山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年８ｈ或１６ｈ取样测湿重ꎬ然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料ꎮ由图３可知ꎬ发酵４０ｈ时ꎬ湿重１８５ｇ/Ｌꎬ酶活４２３Ｕ/ｍＬꎬ随后酶活和湿重随发酵时间增加ꎬ１４４ｈ时湿重出现下降ꎬ至发酵１６８ｈ时下罐ꎬ此时湿重４８２ｇ/Ｌꎬ酶活１３６４４Ｕ/ｍＬꎮ以０.０１ｈ－１和０.０１５ｈ－１的比生长速率进行甲醇补料ꎬ中前期酶活和对照相当甚至比对照低ꎬ但是随着发酵进行ꎬ菌体湿重增大ꎬ甲醇流加量增大ꎬ最终发酵酶活都超过对照组ꎮ图３㊀比生长速率０.０１５ｈ－１时酶活湿重曲线Ｆｉｇ.３㊀Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｗｅｔｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔｃｕｒｖｅａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ０.０１５ｈ－１２.４㊀比生长速率为０.０２ｈ－１时的产酶状况甲醇诱导产酶之前的过程同２.１ꎮ甲醇流加速度从１ｇ/(Ｌ ｈ)开始ꎬ之后按照０.０２ｈ－１乘以相应的湿重(每８ｈ或１６ｈ取样测湿重ꎬ然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料ꎮ由图４可知ꎬ发酵４０ｈ时ꎬ湿重１９０ｇ/Ｌꎬ酶活７１２Ｕ/ｍＬꎬ随后酶活和湿重随发酵时间一直增加ꎬ至发酵１６８ｈ时下罐ꎬ此时湿重５２４ｇ/Ｌꎬ酶活１７４４５Ｕ/ｍＬꎮ以０.０２ｈ－１的比生长速率进行甲醇补料时ꎬ酶活一直比对照和其他两个实验组高ꎬ可以推断前期菌体适应甲醇后ꎬ在一定范围内ꎬ甲醇量越高对产酶越有利ꎮ而以０.０２ｈ－１的比生长速率进行甲醇流加ꎬ最终酶活比对照提高６９.７％ꎬ因此ꎬ以合适的比生长速率控制甲醇流加ꎬ可能会引起菌体代谢流的改变ꎬ更多的代谢能量和物质流向产酶通路ꎮ图４㊀比生长速率０.０２ｈ－１时酶活湿重曲线Ｆｉｇ.４㊀Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｗｅｔｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔｃｕｒｖｅａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ０.０２ｈ－１由图５可知ꎬ随着底糖消耗ＤＯ逐渐降低ꎬ至１６ｈ左右ꎬ底糖耗尽ꎬＤＯ回升ꎬ随之开始补糖流加ꎬ至发酵２４ｈ左右湿重达到１８０ｇ/Ｌꎬ停糖饥饿３０ｍｉｎꎬ此时ＤＯ大幅回升ꎬ然后按照１ｇ/(Ｌ ｈ)的速度流加甲醇３ｈꎬ之后按照各自甲醇流加策略分别进行甲醇流加ꎮ发酵中期ＤＯ水平与甲醇流加量相关ꎬ甲醇流加量大ꎬＤＯ水平低ꎬ而发酵后期ＤＯ基本都跌零ꎬ但是通过对发酵液进行液相检测ꎬ甲醇几乎没有残留ꎮ６４第５期赵凯ꎬ等:不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响图５㊀不同比生长速率下的溶氧量曲线Ｆｉｇ.５㊀Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ３㊀结论以不同的比生长速率进行甲醇流加补料ꎬ发酵酶活均比对照提高ꎮ以０.０１ｈ－１ꎬ０.０１５ｈ－１ꎬ０.０２ｈ－１比生长速率进行甲醇补料ꎬ酶活分别提高１４.４％ꎬ３２.７％ꎬ６９.７％ꎮ以比生长速率指导甲醇补料ꎬ既可以提高甲醇的利用率ꎬ又可以提高酶活力ꎬ从而降低发酵成本ꎮ受取样时间的限制ꎬ本文根据比生长速率进行甲醇流速调整的时间间隔为８ｈ或１６ｈꎬ如果利用可以在线检测菌体密度的发酵反应器ꎬ根据测得的菌体密度在线实时反馈调节甲醇流量ꎬ可能会得到更优的结果ꎮ随着比生长速率的提高ꎬ酶活提高越多ꎬ在ＤＯ允许的情况下ꎬ继续提高比生长速率可能会更大地提高产酶量ꎬ而受反应器及ＤＯ的限制ꎬ本文得到的最适比生长速率为０.０２ｈ－１ꎮ参考文献:[１]李洪淼ꎬ王红宁ꎬ许钦坤.重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００５ꎬ(ｓ１):２９５￣２９８.[２]黄魁英ꎬ夏枫耿ꎬ黄乐天ꎬ等.耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化[Ｊ].现代食品科技ꎬ２０１１ꎬ２７(１０):１２３８￣１２４１.[３]郭美锦ꎬ储矩ꎬ庄英萍ꎬ等.重组毕赤酵母表达工程植酸酶发酵过渡相参数相关分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２００４ꎬ２０(６):９３２￣９３６.[４]闵兆升ꎬ郭会明ꎬ张志强ꎬ等.重组毕赤酵母产植酸酶发酵条件的优化[Ｊ].生物加工过程ꎬ２０１５ꎬ１３(３):３１￣３５.[５]王兴吉ꎬ盛花开ꎬ张杰.产耐热植酸酶重组毕赤酵母发酵条件优化的研究[Ｊ].中国饲料添加剂ꎬ２０１５(１１):１６￣１８.[６]任海涛ꎬ袁景淇ꎬ邓建慧ꎬ等.毕氏酵母流加发酵过程的比生长速率控制[Ｊ].上海交通大学学报ꎬ２００４ꎬ３８(５):７９９￣８０１.[７]魏春ꎬ周祥山ꎬ张元兴.比生长速率和氮源对毕赤酵母生产重组鲈鱼生长激素的影响[Ｊ].微生物学通报ꎬ２００８ꎬ３５(１０):１５２２￣１５２６.[８]槐强强ꎬ贾禄强ꎬ丁健ꎬ等.通过在低细胞浓度下启动甲醇诱导㊁优化碳/能量代谢模式促进毕赤酵母表达Ｍｏｎｅｌｌｉｎ[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１８ꎬ３４(２):２８２￣２９３.[９]刘晓明ꎬ张爱忠ꎬ姜宁ꎬ等.毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究[Ｊ].黑龙江畜牧兽医ꎬ２０１６(１):４１￣４５.[１０]赵林水ꎬ喻晓蔚ꎬ徐岩.ＮＨ＋４离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响[Ｊ].食品与生物技术学报ꎬ２０１６ꎬ３５(６):５９１￣５９６.[１１]武婕ꎬ张晓雪ꎬ余河水ꎬ等.毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２０１６ꎬ３６(１):１０８￣１１４.[１２]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局ꎬ中国国家标准化管理委员会.ＧＢ/Ｔ１８６３４ ２００９饲用植酸酶活性的测定分光光度法[Ｓ].北京:中国标准出版社.[１３]ＳＴＥＡＭＢＯＡＴ.Ｐｉｃｈｉａｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ.[ＥＢ/ＯＬ].[２０１８￣０５￣１５].ｈｔｔｐｓ://ｗｅｎｋｕ.ｂａｉｄｕ.ｃｏｍ/ｖｉｅｗ/０８６００ｅ０５９０ｃ㊀６９ｅｃ３ｄ５ｂｂ７５ｄｂ.ｈｔｍｌ.７４。

毕赤酵母植酸酶基因工程菌高密度培养及诱导表达
王志林;陈庄;朱选;蒋宗勇
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2009(000)010
【摘要】研究了毕赤酵母基因工程菌高密度发酵培养方式和植酸酶基因高效表达策略.采用逐步增加流加方式进行高密度培养,结果发酵液中细胞干重达到64g/L.通过在线检测细胞消耗甲醇的MSUR,估算细胞在单位时间内对甲醇需求量,从而确定甲醇流加速率,采用此种方法可使重组毕赤酵母高水平表达植酸酶,最终发酵上清液中总蛋白量为8.58 g/L,植酸酶活力达到853 U/mL.
【总页数】3页(P158-160)
【作者】王志林;陈庄;朱选;蒋宗勇
【作者单位】广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-335
【相关文献】
1.植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化 [J], 李秀娟;尹玲;李秀珍;黄贤刚
2.植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵 [J], 叶冰;王运吉;张苓花
3.毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素的工艺研究 [J], 姜正军;刘树海;王茂超;程
全明;黄金
4.毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较 [J], 李健;彭远义
5.毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究 [J], 刘林;刘明河
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廛题科夔毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究刘林刘明河(临沂师范学院生命科学学院，山东临沂276005)喃要】Pi chi apas t or i s能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯，是一种极具潜力的酵母表达系统。

以毕赤酵母基因工程茵为实验菌种，探索其在不同条件下的产植酸酶睛况，优化发酵条件，找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。

睽键词]Pi chi apas t or i s；酵母表达系统；植酸酶；发酵条件植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，是一种优良的食品和饲料添加剂，可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，具有良好的饲喂效果，同时，刚氐了磷对环境的污染。

植酸酶真正具有开发价值的仅限于微生物经发酵生产植酸酶。

国外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。

巴斯德毕赤酵母(Pi c hi a pa st or i s)是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯：同时，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产酶隋况，就能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而刚氐生产成本。

1酵母细胞培养时C源的选择由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用，通常在大容量、高密度的酵母培养过程中，需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他表达系统，诱导前又需将之去除。

而对于P．pa st or i s在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物(通常为甘油)，既可以满足细胞生长，又能有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导产酶。

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。

而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。

我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。

［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。

中国生物工程杂志　China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125毕赤酵母高密度发酵工艺的研究林俊涵3(福建生物工程职业技术学院　福州　350002)摘要　高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。

采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。

选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。

采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。

关键词　毕赤酵母　高密度发酵　发酵工艺中图分类号　Q815收稿日期:2008209216 修回日期:20082102173电子信箱:ljh047@ 巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。

高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],S AM 表达量达11.63g/L[4],1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L[5]等。

但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。

目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。

耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化
黄魁英;夏枫耿;黄乐天;明飞平;杜少平
【期刊名称】《现代食品科技》
【年(卷),期】2011(027)010
【摘要】本文对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PEY-2的发酵条件进行研究,结果表明:其摇瓶最佳产酶条件为诱导时间72h,诱导前适宜增殖时间48 h,接种量10％,种龄24h,诱导初始pH 6.0,生长阶段初始pH 5.5.在此基础上进行了50 L罐的发酵中试,50 L罐诱导产酶量达5.0×103 IU/mL,实现了高密度发酵.热稳定性试验表明:植酸酶液pH 2.5,90℃热处理20 min残留酶活69％,pH 5.5,90℃热处理20 min残留酶活75％,热稳定性良好,可以满足饲料高温制粒的要求.
【总页数】4页(P1238-1241)
【作者】黄魁英;夏枫耿;黄乐天;明飞平;杜少平
【作者单位】广州市微生物研究所广东广州510663;广州市微生物研究所广东广州510663;广州市微生物研究所广东广州510663;广州市微生物研究所广东广州510663;广州市微生物研究所广东广州510663
【正文语种】中文
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1.植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化 [J], 李秀娟;尹玲;李秀珍;黄贤刚
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马河
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