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毕赤酵母植酸酶基因工程菌高密度培养及诱导表达
王志林;陈庄;朱选;蒋宗勇
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2009(000)010
【摘要】研究了毕赤酵母基因工程菌高密度发酵培养方式和植酸酶基因高效表达策略.采用逐步增加流加方式进行高密度培养,结果发酵液中细胞干重达到64g/L.通过在线检测细胞消耗甲醇的MSUR,估算细胞在单位时间内对甲醇需求量,从而确定甲醇流加速率,采用此种方法可使重组毕赤酵母高水平表达植酸酶,最终发酵上清液中总蛋白量为8.58 g/L,植酸酶活力达到853 U/mL.
【总页数】3页(P158-160)
【作者】王志林;陈庄;朱选;蒋宗勇
【作者单位】广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640;广东省农科院畜牧研究所,广东,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-335
【相关文献】
1.植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化 [J], 李秀娟;尹玲;李秀珍;黄贤刚
2.植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵 [J], 叶冰;王运吉;张苓花
3.毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素的工艺研究 [J], 姜正军;刘树海;王茂超;程
全明;黄金
4.毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较 [J], 李健;彭远义
5.毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究 [J], 刘林;刘明河
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毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性摘要一种用于重组蚓激酶（rPI239）的表达系统在巴斯德毕赤酵母的发展。
通过1L高密度发酵肉汤制得0.174g上清蛋白。
rPI239体外表现出纤溶活性。
在体内rPI239的活性是通过凝血酶原时间，高岭土部分凝血酶时间，凝血酶时间和纤溶活性测定。
这项工作显示通过巴斯德毕赤酵母和高密度发酵得到的rPI239重组蛋白在体内和体外都具有相似纤溶活性。
关键词蚓激酶；纤维蛋白溶解；毕赤酵母；发酵；活性传统中医学已经长期使用蚯蚓作为药物，因为它们的抗发热和利尿特性。
最近研究表明，在蚯蚓干燥粉末含有纤溶酶组分。
研究人员在日本，韩国和中国已经分离和研究蚯蚓中获得的蚓激酶。
目前的数据显示，在地龙F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2发现的6种同工酶。
1986年，Wu等人，从蚯蚓中分离出的一组蚓激酶组件并且证实他们有激活纤溶酶原的纤溶活性和降解纤维蛋白，而EFE-II证实是纤溶活性蚓激酶的基因。
该作者通过用I125标记患有肺血管阻塞症兔子血管中的内栓子并且显示口服药物EFE-II后有明显纤溶活性。
同工酶（PDBank1IJ7）通过晶体结构分析MIR（多同晶置换）表明它是一个特效弹性蛋白酶S1反应区，表现广泛的底物活性。
最近的研究已经表明蚓激酶是有潜力的溶栓药。
1999年，Sun等人，从地龙中单独分离出蚓激酶PI239，在纤维蛋白板上发现明显纤溶活性。
它的cDNA文库与F-Ⅲ-1/2和EFE-II有89.5％同源性。
该PI239蛋白与那些的的t-PA和u-PA具有相同的活性和底物位点。
在2001年，Manabu 和 Nobuyoshi通过蚓激酶FIII-2在巴斯德毕赤酵母首次表达。
随后的研究已经证明许多种类的重组蚓激酶可以在酵母和大肠杆菌中表达。
近年来，蚓激酶已经在山羊奶表达。
尽管一些报道表明，在制得有效的重组蛋白过程中，资料非常少，，表达条件（特别是高密度发酵条件）也很苛刻，但是在这项研究中，还是完成了一套完整实验过程关于蚓激酶的筛选，表达和在酵母菌中发酵。
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125毕赤酵母高密度发酵工艺的研究林俊涵3(福建生物工程职业技术学院 福州 350002)摘要 高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。
采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。
选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。
采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。
关键词 毕赤酵母 高密度发酵 发酵工艺中图分类号 Q815收稿日期:2008209216 修回日期:20082102173电子信箱:ljh047@ 巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。
高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],S AM 表达量达11.63g/L[4],1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L[5]等。
但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。
目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵及酶学性质分析姓名：李善军学号：2015304120225院系：华中农业大学生科院摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。
经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。
关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。
因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。
蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。
利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。
毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。
将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究刘振云;沈露;解凤立;谭树华【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(30)5【摘要】目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨.方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方.在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵.紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性.结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g·L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%.经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg·L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU·ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍.结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础.%Objective: To evaluate the fermentation process of high-density expressed recombinant aprotinin by Pichia pastoris. Methods: The most optimal formulation of BSM medium for Pichia pastoris to grow using flask culture methods were determined. Based on the study of fermentation in shake flask, the optimal conditions were used for scaling up in 7 L fermentor. Engineering bacteria pSA/GS115 was fermented in fed-batch high density fermentation. The biological activity was determined by ultraviolet absorption assay, and the recombinant aprotinin competitively inhibited the hydrolytic activity of trypsin against substrate BAEE. Results: The best technological parametersof fermentation to BSM medium were glycerol 40 g·L-1, ammonia water 0. 1％ , methanol 1％.Afterbeing optimized, the yield of protein could reach up to 37. 08 mg·ml -1 . The biological activity determined was 4 450 BAEEU·ml-1, 8 folds higher compared to that of shaking flask. Conclusion: The engineering bacteria is successfully fermented in fed-batch high-density fermentation and fermentation produce has a high biological activity, which established a foundation for the large-scale production of aprotinin.【总页数】5页(P744-748)【作者】刘振云;沈露;解凤立;谭树华【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学,药物分析教研室,江苏,南京,21009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6;TQ925.9【相关文献】1.重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化 [J], 马娇颖;章成昌;仇黎鹏;姜玉涛;闫璐颖;陈菁;陈建华2.猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵 [J], 蓝胜芝;于瑞嵩;俞明月;董世娟;曹祥荣;李震3.重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达 [J], 王天成;徐国宾;夏铁安4.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊5.产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究 [J], 曹丁; 李学优; 肖宏艳; 昝继清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母内源蛋白表达系统发酵优化策略随着生物技术和生物医药行业的快速发展，蛋白表达成为了研究和生产领域中一个至关重要的环节。
毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种有效的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白表达、酶制备等领域。
本文将从毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略进行探讨，以期为相关研究提供一定的参考和借鉴意义。
一、毕赤酵母内源蛋白表达系统简介毕赤酵母是一种酿酒酵母，具有真核生物和原核生物的特点，具有许多原核和真核表达系统的优点。
Pichia pastoris作为一种高效的真菌表达系统，广泛应用于蛋白质表达、酶制备、重组激素和疫苗生产、抗体工程等领域。
毕赤酵母在高密度、大规模表达的过程中具有许多优点，例如可以利用化石燃料产生的甲醇为碳源并利用氧化酶将甲醇作为能源，这使得它在蛋白质大规模表达中的应用有了很大的便利；其次methylotrophic yeast P.pastoris是一种易于操作的槽稠传播。
分泌蛋白在生成后由细胞外酶直接切割。
得到的目的蛋白质易纯化和分离。
由于其许多优点，毕赤酵母内源蛋白表达系统在生物技术和制药行业中受到极大的关注。
二、毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略（一）基础培养基的选择在毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵过程中，培养基的选择对于蛋白质的表达和纯化至关重要。
通常情况下，毕赤酵母内源蛋白表达系统常用的基础培养基包括YPG液体培养基、BMGY培养基和BMMY培养基。
其中，BMGY培养基在毕赤酵母的扩大培养和生长过程中被广泛应用，其主要成份包括酵母抽提物（yeast extract）、复合酵母粉（peptone）、甘油（glycerol）和缓冲盐溶液等。
而BMMY培养基主要用于毕赤酵母内源蛋白表达系统的诱导表达过程，其主要成份包括酵母醣（yeast extract）、蛋白胨（peptone）、抗泡剂（anti-foaming agent）以及甲醇（methanol）等。
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。
毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。
这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。
现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。
毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生
产工艺
蛋白酶K是一种广泛应用于医药、食品、化妆品等领域的重要酶类，其生产工艺也越来越受到关注。
近年来，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺备受青睐，下面就来介绍一下其具体生产工艺。
首先，选用高效产酶菌株。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K的关键是选用高效产酶菌株。
目前做得较好的产酶菌株包括曲霉、木霉、产曲霉等。
其次，确定合适的发酵条件。
合理的发酵条件有利于提高蛋白酶K 的生产效率和纯度。
通常采用液态发酵，发酵条件包括温度、pH值、转速、空气流量等，最优发酵条件需根据具体情况确定。
再次，加入适量的培养基。
培养基是微生物发酵生产过程中的营养基础，合适的培养基配方可以提高蛋白酶K的产量和纯度。
培养基的成分包括碳源、氮源、矿物质和微量元素等，其中以大豆粉、麦芽粉和葡萄糖等为碳源，以酵母粉和蛋白质为氮源，再添加一些有机和无机盐类为矿物质和微量元素，能够获得较好的生产效果。
最后，进行后处理。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K后，需要进行后处理以提高其纯度。
后处理主要包括离心、超滤、扩散等操作步骤，其目的是去除蛋白酶K中的杂质和不纯物质，同时保留其酶活性，以便应用到不同领域。
总之，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺在实践中已经被证明是一种成功的方法，具有重要的应用价值。
在生产过程中需要遵循合理的选菌、合理的发酵条件、合适的培养基配方和有效的后处理方法，才能取得最佳的生产效果，同时也必须注意工艺安全和环保等问题。
相信随着技术的不断进步和研发的深入，真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺会更加完善，为各个领域的发展带来更多的机遇。
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。
本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。
微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。
它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。
发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。
要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。
而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。
以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。
它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。
![一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/ba1133f6fad6195f302ba6d4.png)
专利名称：一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法
专利类型：发明专利
发明人：唐语谦,钟凤,陈艺,吴晖,赖富饶,肖俊梅,余以刚,肖性龙,李晓凤,刘冬梅
申请号：CN201310357119.X
申请日：20130815
公开号：CN103436575A
公开日：
20131211
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法。
该培养基配方为：胰蛋白胨19～21g/L，酵母浸膏9～11g/L，磷酸缓冲液终浓度
100mmol/L，无氨基氮源12.8～14.8g/L，生物素4×10g/L，甘氨酸0.05～0.15wt%和体积浓度为0.5％的甲醇，pH为6～8。
本发明还公开了一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，利用本发酵方法发酵毕赤酵母重组菌，可获得高达130mg/L以上的重组蛋白表达量。
申请人：华南理工大学
地址：510640 广东省广州市天河区五山路381号
国籍：CN
代理机构：广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：裘晖
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![人铁蛋白轻链重组毕赤酵母的构建及高密度发酵生产方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/d5d0967f6bec0975f565e278.png)
专利名称：人铁蛋白轻链重组毕赤酵母的构建及高密度发酵生产方法
专利类型：发明专利
发明人：沈鹤霄,华权高,杨琥
申请号：CN201410640019.2
申请日：20141113
公开号：CN104357477A
公开日：
20150218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种人铁蛋白轻链重组毕赤酵母的构建及高密度发酵生产方法，包括人铁蛋白轻链基因编码序列的合成，经过酶切和连接，克隆至表达载体pPIC9k中，再将重组载体转化至毕赤酵母GS115中，通过筛选得到高水平分泌表达的重组毕赤酵母，然后利用发酵罐实现人铁蛋白轻链在发酵罐中高密度生长并得到高效分泌表达。
本发明改变了传统的原核宿主大肠杆菌表达人铁蛋白轻链，通过真核宿主毕赤酵母在发酵罐中的高密度发酵得到了大量人铁蛋白轻链，既保证了人铁蛋白轻链的生物学活性，又节约了成本。
申请人：武汉金开瑞生物工程有限公司
地址：430206 湖北省武汉市东湖高新区高新大道666号生物城创新园B4栋B006号
国籍：CN
代理机构：北京华沛德权律师事务所
代理人：刘杰
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![一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基及其发酵方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/8c0131f488eb172ded630b1c59eef8c75fbf950e.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011394607.4(22)申请日 2020.12.03(71)申请人 西安德诺海思医疗科技有限公司地址 710000 陕西省西安市沣东新城科源三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单元1层B单元2层B单元3层(72)发明人 王俊 周浩 郝东 何华斌 魏文培 侯增淼 (74)专利代理机构 成都睿道专利代理事务所(普通合伙) 51217代理人 蒋丽(51)Int.Cl.C12N 1/16(2006.01)C12P 21/00(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(54)发明名称一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基及其发酵方法(57)摘要本发明涉及酵母菌发酵技术领域，公开了一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基。
本发明还提供了该巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵方法。
本发明可调节毕赤酵母细胞代谢生长、促进外源蛋白表达、抑制蛋白酶活性，更有利于重组蛋白及多肽的稳定表达，且可以调控发酵过程，达到在不使用液氧的条件下，不仅使得巴斯德毕赤酵母菌达到高密度发酵的水平，而且有效缩短整个发酵的周期。
权利要求书2页 说明书9页CN 112501041 A 2021.03.16C N 112501041A1.一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基；所述基础培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～25g/L，K 2HPO 4·3H 2O 1.5～20g/L，MgSO 4·7H 2O 3～16g/L，KCl 2～12g/L，生物素0.02～0.2g/L，葡萄糖50～260g/L，CaCO 3 0.1～1.6g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.002～0.012g/L；所述第一分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO 4·7H 2O 3～16g/L，KCl 2～12g/L，葡萄糖200～1040g/L，CaCO 30.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.006～0.028g/L；所述第二分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO 4·7H 2O 3～16g/L，KCl 2～12g/L，CaCO 3 0.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，甲醇500～880g/L，多元醇6～60g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.006～0.028g/L。
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵及酶学性质分析姓名：李善军学号：2015304120225院系：华中农业大学生科院摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。
经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。
关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。
因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。
蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。
利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。
由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。
毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。
将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。
本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。
1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵1.1种子液培养1.1.1种子培养基YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%）YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2%1.1.2培养温度与菌龄挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。
1.2发酵罐培养1.2.1菌体培养清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下表）无机盐培养基，115℃20min 灭菌，完成后冷却至30℃。
通过补料泵调节pH 值为 5.0，按4%的接种量接种种子液，并加入头孢1g ，PTM1为微量盐87ml （4.35ml/L 发酵液），通气搅拌发酵。
甘油分批阶段完成时,碳源耗尽，DO 急剧上升，时间为24h 。
此时开始补加50%甘油进入甘油补料阶段，时间为6h 。
BSM:1.2.2甲醇诱导开始进行碳源饥饿0.5h ，开始补加甲醇进入甲醇诱导产酶阶段。
同时注意温度保持在30度，罐内压0.05MP,转速500r/min,控制甲醇的流速，每6个小时取样，测量菌体生物量。
2、酶学性质鉴定2.1 酪氨酸标准曲线的制作准确称取干燥的酪氨酸，配置0、20、30、40、40、50、60、70、80ug/ml 的酪氨酸溶液。
用试管分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml ，各加入0.4ml 的碳酸钠5ml ，再加入已稀释的福林试剂1ml ，摇匀放入水浴锅中。
40度保温发色20min ，在分光光度计进行测定（660nm ），测3次，取平均值。
将各浓度的酪氨酸测得OD 值减去0ug/ml 的酪氨酸OD 值得到净OD 值，制作标准曲线如下图1：2.2 确定反应最适ph配制50 mmol/L pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0、pH 12.0、pH 13.0 的缓冲液。
取1 mL不同pH稀释合适倍数的粗酶液，加入1 mL 用相同pH 缓冲液配制的底物，混匀，65℃反应10 min。
以OD660最高的酶活为100%，计算不同pH 条件下的相对酶活。
2.3 确定反应最适温度1)配制合适的ph缓冲液，将粗酶液稀释合适的倍数（根据前面的实验得到最适ph）。
2)取稀释好的酶液1 mL，加入1 mL 2%的酪蛋白底物，分别在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，65℃，70℃，80℃中反应10 min，再加入2 mL TCA溶液终止反应，再保温20 min；3)12000 r/min离心2 min。
取上清1 mL，加入5 mL Na2CO3和1 mL稀释的福林试剂，40℃保温20 min。
4)取 3 mL加到石英比色皿中，紫外可见分光光度计测定OD660，以OD660最高的酶活为100%，计算不同温度条件下的相对酶活。
2.4 酶活检测取试管2支，编号1,2，每管内加入样品（各个样品都需要做）稀释液（根据前面实验得到最佳ph进行缓冲）1mL，置于65℃（得到最佳反应温度）水浴中预热2min，再各加入经同样预热的2%酪蛋白（缓冲液配制） 1mL，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。
然后另取试管2支，编号l, 2，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL 摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定。
将实验组OD值减去对照组OD值得到净OD值。
将得到净OD值带入公式：样品蛋白酶活力单位=A/10*4*N式中：A—由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值）；4—4毫升反应液取出1ml测定（即4倍）；N—酶液稀释的倍数；10—反应时间10min。
一个单位酶活（U）定义为：在65℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸所需要的酶量2.4 金属离子对蛋白酶活性的影响根据最适pH和2%的酪蛋白底物配制反应体系，并分别添加钠、钾、钙、镁、锌、镍的金属离子盐，使反应体系中金属离子终浓度分别为1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，在最适条件下测定蛋白酶活性2.5 SDS-PAGE电泳测取发酵54h、60h、66h、84、90h和96h粗酶液，加入少量溴酚蓝溶液进行点样，同时有标准酶作为对照。
电泳条件：点样：沸水浴5 min，点样量10ul （不稀释）预跑：30v，5min压缩胶：80V, 30min；分离胶：160V，直至溴酚蓝跑出胶的底部3、结果与分析3.1反应最适ph测定将产物酶在不同ph缓冲液中反应，结果如图2所示：图2蛋白酶K最适反应ph从结果可以看出，产物酶在ph8和10时活性最高，在ph7-11之间，酶的活性能达到80%以上，低于ph7或高于ph11时，酶活性快速下降。
3.2反应最适温度将得到的产物酶置于40、50、60、65、70、80度下进行反应，所测的相对酶活结果如图3;图3蛋白酶K最适反应温度从上图可以看出，蛋白酶最适反应温度为65度，在60-70度之间蛋白酶K都有着很高的活性，但到80度是，酶活性急剧下降，下降了约90%。
3.3 毕赤酵母基因工程菌发酵生物量与产物酶酶活测得毕赤酵母基因工程菌在不同发酵时间时的生物量及所在时间产物酶的活性大小结果如图4；生物量(g /L )酶活U从上图可知，在36h 之前毕赤基因工程菌保持生殖生长阶段，工程菌数量快速增长，在此阶段重组酶基因极少表达，重组酶极少。
36h 之后，工程菌数量进入稳定期，菌株开始表达次级代谢产物，酶活也不断增加。
3.4 粗酶液的SDS-PAGE 电泳图4工程菌生物量与产物酶酶活图5 蛋白酶K的SDS-PAGE分析SDS-PAGE电泳结果表明表达产物的分子质量约为31ku，随着时间的推移目标蛋白表达量趋于稳定。
3.5 金属离子对酶活反应的影响将粗酶液放置于不同浓度的金属离子溶液中进行反应，得到的结果如下图所示。
从结果可知，钠离子、钾离子、钙离子和镁离子对酶活反应有促进作用，只有在一定浓度范围内促进作用明显，低于或超过浓度，促进作用会下降。
而镍离子和锌离子对反应有抑制作用，且浓度越高抑制越明显。
4、讨论本实验利用毕赤酵母菌株对蛋白酶K进行重组表达，并通过研究高密度液体发酵和酶学性质得到了其最优的培养条件和酶活性发挥的最佳条件。
从结果可知，在发酵时间在96h时，生物量能达到282g/ml，说明了毕赤酵母菌在高密度发酵有着很大发展空间。
本实验对得到的蛋白酶K进行了一些列的性质测定，包括最适ph、反应温度、金属离子对其影响。
分析发现，重组蛋白酶K最适温度是65度，但是该酶对温度要求并不苛刻，在30度-70度的范围内都有酶活性，并能保持在相对酶活在70%以上，这更好的证明了为什么这种重组蛋白酶K会有更广阔的应用前景。
本实验同样还有一些工作有待完善和改进。
本实验优化了一些毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵的参数，在一定程度上能提高表达量和酶活，但结果并没达到令人满意的结果，可以继续通过优化菌株和发酵罐发酵条件来优化表达条件，提高蛋白酶K的表达量。
5、参考文献黄君，张昌毅，赵述淼，梁运祥.黑曲霉内切_1_4_葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达.华中农业大学，2008，27（5）：611-615.吴彤.在毕赤酵母中高效表达重组蛋白酶 K.[硕士论文]，齐鲁工业大学，2013. 隋少飞，陈松林.巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展.生物技术通报，2004，3：1-4.韩雪清，刘相涛.毕赤酵母表达系统.微生物杂志，2003，23（4）：35-40.孙风敏.密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化.[硕士论文]，大连理工大学，2014.。
