生化仪器分析复习资料-101
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生化仪器分析复习资料1、分子内部三种运动形式，对应的能级分子内电子相对原子核的运动（称为电子运动）——电子能级分子内原子在其平衡位置上的振动（称分子振动）——振动能级以及分子本身绕其重心的转动（称分子转动）——转动能级2、分子轨道的四种跃迁，其中属于紫外-可见光谱电子跃迁类型是（1）σ→σ*跃迁所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。
饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ<200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)甲烷：λmax=125 nm 乙烷：λmax=135 nm该类化合物的紫外-可见吸收光谱应用价值很小。
（2）n→σ*跃迁所需能量较大。
吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。
含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ* 跃迁。
CH3OH：λmax=183 nm 、CH3NH：λmax=213 nm大多数吸收峰λmax小于200nm，难以检测到（3）π→π*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型）所需能量较小，吸收波长处于近紫外区，λmax ~200nm摩尔吸光系数εmax≥104，属于强吸收。
不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁（4）n→π*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型）需能量最低，吸收波长λ>200nm。
是生色团中的未成键孤对电子向π*轨道跃迁。
属于禁阻助跃迁，εmax＜100，是弱吸收带。
3、生色团、助色团、红移、蓝移、增色效应、减色效应生色团a)最有用的紫外—可见光谱是由π→π*和n→π*跃迁产生的。
这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。
b)这类含有π键的不饱和基团称为生色团。
c)简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。
助色团有一些含有n非成键电子对的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200 nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。
红移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）；蓝移：吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应4、饱和烃化合物、不饱和烃化合物紫外-可见吸收光谱的特点，蛋白质、核酸的紫外可见吸收光区饱和烃及取代烃饱和单键碳氢化合物含有C-H和C-C键，只含有σ键电子, 一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区；因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，所以应用不多；这类化合物在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等不饱和烃及共轭烯烃这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有π电子，吸收能量后可产生π－π*跃迁由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带特点：强度大，摩尔吸收系数大，通常在104－2×104 L mol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217－280nm；K吸收带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关蛋白质紫外吸收光谱构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。
在近紫外区(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有吸收光的能力。
苯丙氨酸的lmax＝257nm，酪氨酸的lmax＝275nm，色氨酸的lmax＝280nm核酸紫外吸收由于嘌呤碱和嘧啶碱紫外线吸收特性，所以核酸分子具有紫外吸收性质一般在260nm左右有最大吸收峰（蛋白质在280nm），可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据5、透光度和吸光度的关系，朗伯-比尔定律的公式，注意ε和a分别表示什么透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)：T=Ⅰt / Ⅰo•为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)概念：朗伯-比尔定律的公式：A=εbc=abc( 波长一定）当b以cm, c以g/L为单位时, 吸光系数以a表示: a=A/(bc)当b以cm, c以mol/L为单位时, 摩尔吸光系数以ε表示：ε=A/(bc)6、偏离朗伯-比尔定律的因素（单色光和溶液的浓度）光学因素(1)非单色光的影响：Lamber-Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光。
一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定(2)杂散光的影响：杂散光：指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差消除办法：提高仪器自身的性能(3)反射光和散射光的影响：toIILogTLogA==1反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响，产生假吸收的现象，使T↓，A↑，吸收光谱变形※注：一般可用空白对比校正消除(4)非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形化学因素•Beer定律适用的另一个前提：稀溶液；浓度过高会使C与A关系偏离定律•溶质浓度过高（>0.01mol/L), 吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力，浓度越大，这种影响就越大•溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化※消除办法：采用稀溶液分析7、紫外可见吸收光谱仪的组成部件，光源的选择、单色器的作用、吸收池的选择光源基本要求：发射强度足够且稳定的连续光谱;光辐射强度随波长的变化小;有足够的使用寿命常用类型：白炽光源与气体放电光源．•白炽光源：钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000nm•气体放电光源：氢灯或氘灯－紫外光源200～600 nm单色器：能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置光栅吸收池1吸收池功能：用于盛放分析试样2 材料玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区3 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向检测器功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置信号指示系统作用：放大信号并以适当方式指示或记录下来8、单光束分光光度计的特点、双光束分光光度计的特点、双波长分光光度计的特点单光束分光光度计特点：（1）使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差（2）结构简单，操作方便，维修容易（3）不能作全波段光谱扫描双光束分光光度计特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差，简化测定程序;可以自动扫描吸收光谱双波长分光光度计特点：适用于分析多组分混合物，混浊试样（如生物组织液）。
测量时使用同一吸收池，不用空白作参比，消除了参比池的不同和制备空白溶液的影响9、定性分析的方法，会根据woodward规则判断、比较不同化合物的波长大小（PPT第2章p65~p68）（1）相同测定条件下，比较未知物和已知标准物的紫外光谱图待测样品相同条件样品谱标准物质标准谱主要对比εmax ，λmax及峰数目是否一致εmax：化合物特性参数，可作为定性依据；εmax ，λmax及峰数目都相同，可能是一个化合物；（2）用经验公式计算λmax，与实验结果对照10、紫外可见吸收光谱的定量分析过程（参考实验的步骤），注意分析条件的选择（选择λmax为入射光波长，样品浓度的选择）（1）首先确定标准蛋白溶液的最大吸收波长，作测量波长（2）标准曲线的制作：用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在所选的测量波长上分别测定所配标准溶液的吸光度，记录所得读数。
以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（3）样品测定：取待测溶液，按上述方法测定测量波长处的吸光度。
根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出待测蛋白质的浓度分析条件的选择选择适当的入射波长：在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏；一般应该选择λmax为入射光波长，但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长（4）选择合适的参比溶液：a.若待测组分简单，共存组分少，且在测波长处无吸收，用纯溶剂（水）作参比溶液。
b.若显示剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，采用不加样，同时加入试剂和溶液作参比溶液（5）控制适宜的吸光度（读数范围）：测量误差与吸光度读数有关，A=0.434，吸光度测定误差最小。
A选在0.15-1.00范围内，T在70%-100%，可以保证浓度测量的相对误差小于5%11、红外吸收光谱和紫外-可见吸收光谱的异同点相同点：同为吸收光谱法；都是由于分子中的能级跃迁产生的不同点：（1）光波长不同。
红外是指0.75～1 000µm的电磁辐射；紫外可见通常指200-750nm （2）分子跃迁能级不同。
紫外也称电子光谱。
是由于分子中价电子跃迁所产生的；红外光谱称为振转光谱，是振动和转动能级跃迁产生的（3）研究对象和使用范围不同。
紫外光谱只能分析不饱和有机化学物。
特别是有共轭体系的化合物及少数无机物，所以紫外可见用于定性分析较少，多用于定量，红外适用于分析那些分子振动偶极矩变化不为0的化合物，除了少数分子外（单原子分子He、同核分子O2），几乎所有有机化合物都可用红外分析法研究应用范围广，多用于定性（红外的摩尔吸收系数低，定量效果不如紫外-可见）（4）吸收光谱图不同紫外可见吸收光谱：横坐标：波长（nm）纵坐标：吸光度A红外吸收光谱：横坐标：波数（cm－1）纵坐标：透射比12、红外光区分为哪三个区，常用的是哪个区，懂得波数和波长间的转换红外光区的划分：红外光谱在可见光区和微波光区之间，其波长范围约0.75～1000μm。
习惯上将红外光区划分为三个区域：近红外、中红外（常用）、远红外。
绝大多数有机物和无机离子的化学键基频吸收都出现在中红外区。
通常说的红外光谱实指中红外光谱区13、分子中基团的振动形式包括哪几种伸缩震动、变形震动。
伸缩振动的k比变形振动k大；因此伸缩振动出现在红外吸收光谱的高波数区，变形振动出现在红外吸收光谱的低波数区14、线性分子、非线性分子振动自由度的计算线形分子：振动自由度= 3N-5非线形分子：振动自由度= 3N-615、红外光谱区分为哪两个区域，波数范围分别是官能团区：特征吸收峰是由分子伸缩振动产生的，能用于鉴定基团；波数范围为4000～1300cm-1 ；指纹区：特征吸收峰是由单键的伸缩振动、变形振动产生的，能用于鉴定分子结构的细微区别，多用于对结构类似化合物的鉴定。
