血清直接胆红素测定

直接胆红素测定的标准操作规程【目的】体外检测血清直接胆红素（DBIL）的含量。

【职责】1.实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。

2.本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。

【标本类型及实验前准备】1.受检者的准备病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。

体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。

注意有无应用影响测试项目的药物。

此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。

对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。

2.静脉采血除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。

体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。

在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。

【仪器设备】东芝TBA-FX8全自动生化分析仪，低速离心机一、检测原理钒酸盐胆红素胆绿素PH3.0测定钒酸盐作用前后吸光度差异，可求标本中直接胆红素的浓度。

二、试剂1.试剂本科使用北京利德曼生化股份有限公司DBiL试剂盒，为液体双试剂，各组分如下：2.校准要求使用去离子水与校准品两点定标，详见说明书；正常情况下，应每两周对测定进行一次校准。

三、操作测定（试剂准备液体试剂，直接使用，无需配制。

）四、计算DBIL=校准液（△A=A2-A1）×(△A标准/△A校准)五、质控程序1.建议采用朗道水平2(正常范围质控）和水平3（病理范围质控）两个水平的血清进行室内质控。

2.可接受性判断质控物的检测值应在给定质控范围，或可以通过参加卫生部室间质评对实验室的运作情况进行系统评估。

3.质控操作每日进行样本检测之前首先应进行质控操作，以考察系统的在控情况。

如果检测结果符合质控要求则进行样本操作；如果不符合质控要求，则应重复质控操作，以排除可能发生的偶然误差；如果仍不符合质控要求，则应考虑质控品的重新准备、试剂的重新校准或更新、仪器的维护等。

血清直接胆红素（D-BIL）测定1. 实验原理直接胆红素与2,4-二氯苯胺重氮盐形成重氮化合物，在酸性条件下呈红色。

2. 标本：2.1 病人准备：无特殊要求。

最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。

2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。

3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。

4. 标本运输：常温条件下避光保存运输。

5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。

6. 实验材料6.1 试剂：申能总胆红素试剂盒：141 0827170 1 试剂＋试剂26.1.1 试剂组成试剂1：16×64mlEDTA-Na2 0.07mmol/L氯化钠 6.6g/L氨基磺酸 70mmol/L试剂2：6×16ml2,4-二氯苯胺重氮盐 0.09mmol/L盐酸 130mmol/LEDTA-Na2 0.02mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂有效期为18个月。

试剂2必需避光保存。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。

6.1.5 注意事项：此试剂为体外诊断用。

警告！腐蚀剂！不要入口。

避免和眼睛，皮肤或衣服接触。

如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。

接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。

6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU680生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验贝克曼AU680生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验贝克曼AU680生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

目录修订页编写者：陈晓玲审核者：王沛批准者：王沛血清总胆红素(T-BIL)测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。

2 实验原理在酸性溶液中，样本中的总胆红素被钒酸盐氧化生成胆绿素的同时，在450nm波长处可引起吸光度的下降。

其在450nm波长处引起吸光度的变化值与样本中总胆红素的浓度成正比。

通过在450nm波长处测定吸光度的变化值即可测得样本中总胆红素的浓度。

3 标本3.1 病人准备：无特殊要求。

最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。

3.2 类型：血清3.3 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融。

3.4 标本运输：常温条件下避光保存运输。

3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。

4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司总胆红素试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：柠檬酸缓冲液100mmol/L 表面活性剂 1.0%试剂2（R2）：磷酸盐缓冲液200mmol/L 偏钒酸钠 3.8mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存编写者：陈晓玲审核者：王沛批准者：王沛4.1.3.2有效期：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自检定合格之日起有效期为18个月。

4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。

4.1.5 注意事项：此试剂为体外诊断用，不要入口，毒性还末确定；避免和眼睛，皮肤或衣服接触，如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟，接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。

4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的TBIL校准品对自动分析仪进行校准。

4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。

血清直接胆红素的测定病人准备：要求病人处于安静状态，生活状态处于日常状态，避免过度空腹、饮食、饮酒吸烟标本采集，处理，保存和要求：收集无溶血，无黄疸，无脂浊的新鲜血清或肝素血清，避光保存。

混合，必要时可用过滤器过滤。

实验原理：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素。

醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完全后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的黄色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线找直接胆红素含量。

实验仪器设备及试剂：咖啡因试剂碱性酒石酸钠溶液5g/L亚硝酸钠溶液5g/L 对氨基苯磺酸溶液5g/L叠氮钠溶液胆红素标准溶液加样枪分光光度计（或半自动生化仪）实验操作：一。

取两支试管，按表1操作表1 改良J—G发测定血清直接胆红素操作表加入物 (ml) 直接胆红素空白管血清0.2 0.2咖啡因苯甲酸钠试剂— 1.6对甲基苯磺酸—0.4重氮试剂0.4 —混匀，准确1分钟重氮钠0.05 —咖啡因甲苯酸钠试剂 1.55 —室温10分钟碱性酒石酸钠 1.2 1.2混匀，600nm波长比色，以空白管调0，读取各管吸光度。

从标准曲线上查出直接胆红素浓度。

二．标准曲线的制作表2 胆红素标准曲线的制作表加入物 (ml) 对照管 1 2 3 4 5胆红素标准贮存液— 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0稀释血清 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 —相当于胆红素浓度 0 34.2 68.4 103 137 171（u mol/L)混匀（不可产生气泡),按直接胆红素的测定方法操作。

每一浓度做2个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各管吸光度的均值为纵坐标，以相应胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。

参考范围：血清结合胆红素0~6.8umol/L(0~0.4mg/dl）注意事项：1.本法在10 —37℃范围内测定，不受温度变化的影响，两小时内显色非常稳定且灵敏度高，轻度溶血对本法无影响。

血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良J-G法、二甲亚砜法、二氯苯重氮盐法和2，5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相色谱法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。

改良咖啡因（J-G）法：一、实验原理血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。

咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的PH值同时兼有加速作用。

叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应。

最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。

最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。

二、实验方法（一）器材试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱。

（二）试剂1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，EDTANa2 0.5g，溶于约500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。

2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。

3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约800mL 蒸馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。

4. 重氮试剂临用前，取5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液（试剂3）20mL 混合。

5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。

血清胆红素的实验报告研究背景血清胆红素是一种重要的临床生化指标，用于评估肝功能和溶血性贫血等疾病的诊断和治疗过程中的效果。

因此，对血清胆红素的准确检测方法进行研究和优化，对临床检验具有重要意义。

实验目的本实验旨在探索一种简便、准确、实用的方法来测定血清胆红素的含量。

实验原理本实验利用了二甲基亚硝胺(DMA)与胆红素在酸性条件下的化学反应，生成红色的胆红素硝基胆红素(DMN)。

DMN与高碱溶液结合形成蓝色的复合物，其最大吸收波长为576nm。

根据DMN与胆红素的反应关系，通过测量吸光度来确定血清样品中胆红素的含量。

实验材料和方法材料：1. 血清胆红素标准品2. 二甲基亚硝胺溶液3. 磷酸盐缓冲溶液4. 纯水5. 高碱溶液方法：1. 准备标准曲线：分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的血清胆红素标准品，加入离心管中。

2. 加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。

3. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。

4. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍，即得到标准曲线的各个浓度标准溶液。

5. 测定各个标准溶液的吸光度，并记录。

测量待测样品1. 取待测样品3 mL，加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。

2. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。

3. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍。

4. 测量吸光度，并根据标准曲线计算出样品中胆红素的含量。

实验结果及分析标准曲线根据所制备的标准曲线，测量各个标准溶液的吸光度，得到以下数据：胆红素标准溶液（mL）吸光度0.1 0.2340.2 0.4210.4 0.8230.6 1.2330.8 1.602待测样品测量结果测量待测样品后，得到其吸光度为0.845。

根据标准曲线的线性方程（y = 1.957x + 0.095，R²=0.998），可以计算出待测样品中胆红素的含量。

血清胆红素（SB）包括血清总胆红素、直接胆红素、间接胆红素. 血清总胆红素升高的值反映黄疸程度.胆红素总量增高、间接胆红素增高：常见于溶血性贫血，血型不合输血，恶性疟疾，新生儿黄疸等。

胆红素总量增高、直接与间接胆红素均增高：见于急性黄疸型肝炎，慢性活动性肝炎，肝硬变，中毒性肝炎等。

胆红素总量增高、直接胆红素增高：见于肝内及肝外阻塞性黄疸，胰头癌，毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合征等胆红素测定：常分为总胆红素（TBiL）、直接胆红素（DBiL）、间接胆红素（IBiL）,三项均升高提示为肝细胞性黄疸；胆囊结石、胆囊炎、胆道梗阻伴黄疸时常为阻塞性黄疸，TbiL 与DbiL增高；若TbiL与IbiL增高常为溶血性黄疸黄疸的分类方法较多，计有：一按照黄疸的发生机理及病因可分：（一）溶血性黄疸；（二）细胞性黄疸；（三）胆汁淤积性黄疸；（四）先天性非溶血性黄疸；（五）多因性黄疸。

此分类方法已在临床上广泛应用，其先天性非溶血性黄疸相对少见，溶血性黄疸亦仅占一小部分，绝大多数为肝细胞性和汁淤积性黄疸(如病毒性肝炎、肝硬化、胆炎、胆石症和肿瘤所引起)。

先天性非溶血黄疸呈慢性波动性黄疸，多见婴幼儿或青年，常有家族史，其发病机理是先天性肝细胞对胆红素摄取、结合、排泄分别或混合障碍，偶而也可获得性——炎后高胆红素血症。

多因性黄疸病因有两种病并存，病情多数复杂而严重，预后较差，病死率高。

二根据黄疸发生的部位可分为肝前性黄疸(溶血性和非溶血性)、肝性黄疸(肝细胞性和肝胆小管性即肝内胆淤性)、肝后性(肝外梗阻性)。

三按照胆红素性质分类（一）以非结合胆红素（非酯型）升高为主的黄疸1 胆红素来源过多如先天性溶血性黄疸、后天获得性溶血性黄疸、由无效造血引起的旁路性高胆红素血症。

2 胆红素摄取障碍如新生儿黄疸(Y、Z蛋白不足)、轻型Gilbert综合征、肝炎后高胆红素血症、一些药物及检查用的试剂(如胆囊造影剂)等引起的黄疸。

3 胆红素酯化障碍(葡萄糖醛酸转移酶活力减低或缺如如重型Gilbert综合、Grigler-Najjar综合征(Ⅰ型与Ⅱ型)、新生儿生理性黄疸，家族性一过性黄疸(Lucey-Driscoll病)、哺乳黄疸(孕二醇)、某些药物如新霉素、利福平抑制醛糖酸移换酶活性引起黄疸。