双向凝胶电泳

双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。

在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。

80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。

由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。

此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。

这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。

第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。

其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。

用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。

蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。

最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。

现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。

双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。

NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。

2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。

3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。

4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。

2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。

蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。

2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。

表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。

简述双向电泳的原理
双向电泳是一种在凝胶电泳中使用的技术，用于分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物分子。

其原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，以便在凝胶中获得更好的分离效果。

在双向电泳中，首先在一个方向上施加电场，使待分离的生物分子向一个方向移动。

然后，改变电场的方向，使其在另一个方向上移动。

这样，生物分子会在两个方向上进行移动，从而实现更好的分离效果。

双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和电泳技术。

在凝胶电泳中，待分离的生物分子会在凝胶矩阵中随着电场的作用而移动，根据其大小和电荷的不同而被分离开来。

而双向电泳则是在凝胶电泳的基础上，通过改变电场的方向，使生物分子在两个方向上移动，以获得更好的分离效果。

双向电泳在生物分子分离和分析中具有重要的应用，尤其在蛋白质分离和分析中，可以帮助科研人员更准确地分离和鉴定不同的蛋白质。

通过掌握双向电泳的原理和技术，科研人员可以更好地开展生物分子研究，为生命科学领域的发展做出贡献。

总之，双向电泳的原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，在凝胶中实现更好的分离效果，具有重要的生物分子分离和分析应用。

双向凝胶电泳原理(一)双向凝胶电泳什么是双向凝胶电泳双向凝胶电泳，英文名字为Bisulfite-Sequencing PCR，缩写为BSP，是一种检测DNA甲基化的方法。

双向凝胶电泳主要是将DNA进行酶切、连接、甲基化等处理，然后采用PCR扩增方法得到一组产物，经过电泳反应，通过测量DNA片段长度的差异和带的强度来检测DNA的甲基化状态。

双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳的原理是利用亲核性亚硫酸酯对甲基化的DNA进行转化，通过反应后将DNA分成两条互补链，在两条链上分别添加标记，如磷酸酯和辣根过氧化物酶等。

其中，磷酸酯标记的DNA是单链的，而辣根过氧化物酶标记的DNA是双链的，可以通过电泳移动。

在电泳过程中，根据DNA带的大小和强度，判断DNA片段的长度和甲基化状态。

双向凝胶电泳的步骤双向凝胶电泳需要进行以下五个步骤：1.DNA甲基化转化：将DNA处理为亲核性亚硫酸酯，反应生成甲磺酰脲基化的DNA片段。

2.PCR扩增：将转化后的DNA进行PCR扩增，得到一组产物。

3.芯片制备：将PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后将DNA嵌入在聚合物芯片上。

4.双向标记：在两个DNA链上分别添加辣根过氧化物酶和磷酸酯等标记。

5.双向凝胶电泳：将DNA芯片通过电泳反应，根据DNA带的大小和强度，判断甲基化的DNA状态。

双向凝胶电泳的应用双向凝胶电泳主要应用于检测DNA甲基化状态、遗传疾病、肿瘤等方面。

在癌症研究中，双向凝胶电泳可以检测癌细胞的DNA甲基化状态，有助于癌症的早期诊断、治疗以及预测复发等方面。

此外，双向凝胶电泳还可以应用于基因组学、生物研究、医学科研等方面。

总结双向凝胶电泳是一种检测DNA甲基化状态的方法，通过亲核性亚硫酸酯对DNA进行转化，采用PCR扩增方法得到产物，再通过电泳反应来判断DNA片段的长度和甲基化状态。

双向凝胶电泳在生物研究、医学科研和癌症研究方面的应用非常广泛，未来也将是一个热门的研究方向。

双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。

首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。

凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。

常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。

第一步是水平电泳。

在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。

这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。

在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。

大分子移动缓慢，小分子移动快速。

这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。

这个方向通常被称为水平电泳通道。

第二步是垂直电泳。

在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。

这个方向通常被称为垂直电泳通道。

在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。

正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。

这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。

最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。

这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。

总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。

通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。

蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。

2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。

等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。

通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。

这个阶段的电流较低。

3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。

4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。

通常使用SDS-凝胶。

该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。

这个阶段的电流较高。

5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。

然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。

解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。

2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。

这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。

3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。

较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。

4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。

这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。

蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。

通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。

这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。

蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

二、关键参数分辨率和可重复性。

目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。

采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。

建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。

灵敏度。

双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。

双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。

三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。

双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。

现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。

四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。

双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。

双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。

成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。

通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。

然后把差别点切出，进行脱色、酶解。

最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。

通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。

原理：
1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。

2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。

样品要求：
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2ug/ul；
由于蛋白质组学涉及的样品范围很广，对于具体样品的要求请和项目经理联系。

仪器：
1st dimension:第一项
IEF:IPG-PhorII(GE)and Protean IEF(BioRad) Bio-Rad Model111Mini IEF Cell
2nd dimension:第二项
GE Ruby SE600(16x16cm)
GE Ettan DALTsix(26x20cm)
BioRad Criterion pre-cast(13x9cm)
BioRad Protean(8.6x7cm)
2D凝胶图像识别软件
Image master2D Elite®
实例分析。

双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于电泳的原理和凝胶电泳的原理。

电泳原理：电泳是利用物质在电场中的带电性质而产生的运动现象。

在电场中，带电的分子或离子会受到电场力的作用而向相对带电性质相反的极移动。

电泳实验中，通常使用平行的电极极板，形成一个电场，分子或离子会在电场中进行迁移和分离。

凝胶电泳原理：凝胶电泳是在分离过程中使用凝胶作为介质，使得被分离物质在凝胶中进行迁移和分离。

凝胶是具有三维网状结构的聚合物或芯粒，可以提供一定的分子筛效应，使得分子按照大小逐渐沉积。

分子越大，迁移速度越慢，分离效果越好。

双向凝胶电泳原理：双向凝胶电泳是在凝胶电泳的基础上，通过在电泳过程中改变电场方向，实现不同方向上的分离。

通常情况下，第一维电泳是水平电场电泳，第二维电泳是垂直电场电泳。

具体步骤如下：1. 首先，将样品加入到凝胶电泳样品槽内，通常是在蛋白质样品中加入还原剂和样品缓冲液，使其在电泳过程中具有一定的带电性质。

2. 准备两个平行的平板凝胶，其中一个用于第一维电泳，另一个用于第二维电泳。

凝胶通常是聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖双层凝胶。

第一维电泳凝胶的方向通常是水平的，第二维电泳凝胶的方向通常时垂直的。

3. 将第一维电泳凝胶浸泡在浸泡液中，然后将电泳样品加入到凝胶中定位。

开启电源，施加电场使样品在凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。

可以根据需要调整电场的强度和时间。

4. 当第一维电泳结束后，将凝胶取出并固定，然后将其放入第二维电泳凝胶中。

将电泳样品加入到第一维凝胶的上方定位。

5. 开启电源，施加电场使样品在第二维凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。

6. 最终，根据分子的大小和电荷，样品中的蛋白质会在凝胶中形成一系列分离带，可以通过染色等方法观察和分析分离结果。

通过双向凝胶电泳，可以实现对复杂混合物中的蛋白质的分离和分析，便于进一步的研究和应用。