发酵维生素K2简介20170216

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010562405.X(22)申请日 2020.06.18(71)申请人 内蒙古金达威药业有限公司地址 010206 内蒙古自治区呼和浩特市托克托工业园区申请人 厦门金达威集团股份有限公司(72)发明人 陈必钦　钟锦潮　严必能　李丹　吴轶　詹光煌　(74)专利代理机构 厦门市精诚新创知识产权代理有限公司 35218代理人 方惠春(51)Int.Cl.C12P 7/66(2006.01)C12N 1/38(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01)C12R 1/20(2006.01)C12R 1/10(2006.01)C12R 1/07(2006.01)(54)发明名称一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法(57)摘要本发明属于维生素K2制备领域，具体涉及一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，该方法包括分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；和/或，在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种。

采用本发明提供的方法制备维生素K2，能够很好地满足维生素K2发酵在生长及合成等各阶段对培养条件的不同需求，促进菌体生长及产物合成，能够非常有效地提高维生素K2的发酵水平，所得发酵产物中维生素K2含量较高。

权利要求书1页 说明书18页CN 111549079 A 2020.08.18C N 111549079A1.一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，其特征在于，该方法包括在发酵培养阶段，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；和/或，在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种；分阶段控制OUR的方式如下：发酵0～4h OUR控制在20～80mmol/L ·h，4～12h OUR控制在80～160mmol/L ·h，12～24h OUR控制在60～140mmol/L ·h，24～60h OUR控制在40～100mmol/L ·h，60～140h OUR控制在20～90mmol/L ·h；分阶段控制发酵液中ORP的方式如下：发酵0～4h发酵液中ORP控制在60～150mV，4～12h发酵液中ORP控制在-80～100mV，12～24h发酵液中ORP控制在-50～120mV，24～60h发酵液中ORP控制在-20～160mV，60～140h发酵液中ORP控制在20～220mV；分阶段控制发酵液中乳酸浓度的方式如下：发酵0～4h发酵液中乳酸浓度控制在1～20mg/L，4～12h发酵液中乳酸浓度控制在5～50mg/L，12～24h发酵液中乳酸浓度控制在10～100mg/L，24～60h发酵液中乳酸浓度控制在30～150mg/L，60～140h发酵液中乳酸浓度控制在50～100mg/L。

维生素k2维生素K2是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。

折叠编辑本段基本信息折叠基本概述中文名称:维生素K2中文别名:维生素K2英文别名:Vitamin K 2; Vitamin K2; Vitamin K2 (generic); 2-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl]-3-methylnaphthalene-1,4-dioneCAS:11032-49-8EINECS:234-264-5折叠作用(1)治疗和预防骨质疏松症，维生素K2生成骨蛋白质，再与钙共同生成骨质，增加骨密度，防止骨折。

(2)维生素K2可预防肝硬化进展为肝癌。

(3)治疗维生素K2缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间。

(4)具有利尿、强化肝脏的解毒功能，并能降低血压。

折叠研究进展1934 年，丹麦科学家首先发现维生素K，并证实其为脂溶性维生素。

维生素K是一类具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物。

天然存在的有维生素K1、K2，维生素K1广泛存在于绿色植物中，是食物中维生素K的重要来源;维生素K2主要由肠道细菌合成。

人工合成的有维生素K3、K4、K5、K7等。

在动物体内具有生物活性的是维生素K2，而维生素K1和维生素K3都要转化为维生素K2才能起作用。

三种维生素K的形式都在肝中转化成维生素K2，并和胃肠微生物合成的维生素K2一起被吸收利用。

维生素的每日需要量甚少(常以毫克或微克计，如人每天约需VA0.8-1.7mg、VB11-2mg、VB21-2mg、泛酸3-5mg 、VB62-3mg、VPP10-20mg、生物素0.2mg、叶酸0.4mg、VB121 μ g、VD0.01-0.02mg、VE14-24mg、VC60-100mg、维生素K2 婴儿10~20μg及成人70~140μg.然而由于许多食物中富含维生素K及肠道细菌能合成维生素K。

维生素K2（1）治療和預防骨質疏鬆症，維生素 K2 生成骨蛋白質 ,再與鈣共同生成骨質 ,增加骨密度, 防止骨折。

（2）維生素K2 可預防肝硬化進展為肝癌。

（3）治療維生素K2 缺乏性出血症，促進凝血酶原的形成，加速凝血，維持正常的凝血時間。

（4）具有利尿、強化肝臟的解毒功能，並能降低血壓。

目錄[隱藏]•1研究進展•2缺乏後果o 2.1新生兒、嬰兒易發o 2.2維生素K2 缺乏性出血臨床特點•3應用前景•4藥用及保健功能o 4.1治療和預防骨質疏鬆症o 4.2維生素K2 可預防肝硬化進展為肝癌•5市場狀況研究進展1934 年，丹麥科學家首先發現維生素 K ，並證實其為脂溶性維生素。

維生素K是一類具有葉綠醌生物活性的萘醌基團的衍生物。

天然存在的有維生素 K1 、 K2 ，維生素 K1 廣泛存在於綠色植物中，是食物中維生素 K的重要來源；維生素 K2主要由腸道細菌合成。

人工全盛的有維生素 K3 、 K4 、 K5 、 K7 等。

在動物體內具有生物活性的是維生素 K2，而維生素 K1 和維生素 K3 都要轉化為維生素 K2 才能起作用。

三種維生素K 的形式都在肝中轉化成維生素K2 ，並和胃腸微生物合成的維生素 K2 一起被吸收利用。

維生素的每日需要量甚少 (常以毫克或微克計，如人每天約需 VA0.8-1.7mg 、 VB11-2mg 、 VB21-2mg 、泛酸 3-5mg 、 VB62-3mg、 VPP10-20mg、生物素 0.2mg 、葉酸 0.4mg 、VB121 μ g 、VD0.01-0.02mg 、VE14-24mg 、VC60-100mg 、維生素 K2 嬰兒10~20μg及成人70~140μg.維生素K 是人體中不可缺少的重要維生素之一。

然而由於許多食物中富含維生素 K 及腸道細菌能全盛維生素 K 。

健康成人和年長兒童一般不會因膳食供給不足發生維生素 K 缺乏。

由於維生素 K能迅速改善由於維生素K缺乏引起的出血，幾十年來維生素K一直用於治療出血的抗凝劑，似乎不作為人體內一種重要營養物被關注。

大豆发酵产生维生素k2的原因
大豆发酵产生维生素K2的原因主要是由于大豆中的某些微生物在发酵过程中能够将大豆中的某些物质转化为维生素K2。

这些微生物通常是一些有益的细菌或真菌，例如乳酸菌、酵母菌等。

在发酵过程中，这些微生物会利用大豆中的某些物质作为营养来源，并产生维生素K2等代谢产物。

具体来说，大豆中的某些成分，如大豆异黄酮、大豆皂苷等，可以被这些微生物分解代谢，转化为维生素K2。

这些微生物中的一些可以产生维生素K2的酶类，将大豆中的物质转化为维生素K2。

这些酶类的作用是催化大豆中的某些物质发生氧化还原反应，从而形成维生素K2。

此外，大豆发酵过程中还可能涉及到其他因素，例如温度、湿度、pH值等。

维生素k2生产技术维生素K2生产技术维生素K2，也被称为甲基化骨化酮（MK），是一种脂溶性维生素，对于骨骼健康和心血管功能至关重要。

维生素K2可以通过合成或发酵来生产，下面将介绍维生素K2的生产技术。

一、合成法生产维生素K2合成法是生产维生素K2的主要方法之一。

合成维生素K2的关键原料是对苯二酮（对苯二酮是维生素K2的前体物质）和异丙醇。

具体的生产工艺如下：1. 首先，将对苯二酮和异丙醇在适当的溶剂中进行混合，并加入一定的催化剂。

2. 然后，将混合物进行加热和搅拌，使其反应。

3. 在反应过程中，控制温度、时间和催化剂的用量，以确保反应的高效性和选择性。

4. 反应结束后，通过结晶、过滤、洗涤等步骤，将维生素K2从反应物中分离出来。

5. 最后，对分离得到的维生素K2进行干燥、粉碎、包装等处理，即可得到成品。

合成法生产维生素K2的优点是工艺简单、操作方便、生产周期短，适用于大规模生产。

然而，合成法生产的维生素K2与天然维生素K2的结构稍有差异，可能存在一定的生物利用度差异。

二、发酵法生产维生素K2发酵法是另一种常用的维生素K2生产方法。

它利用某些微生物（如植物乳杆菌、曲霉菌等）通过发酵代谢产生维生素K2。

发酵法生产维生素K2的步骤如下：1. 首先，选择合适的菌株，将其培养在适当的培养基中。

2. 在培养过程中，控制温度、pH值、氧气供应等条件，促使菌株生长和代谢。

3. 菌株代谢过程中，产生维生素K2。

4. 培养结束后，通过离心、过滤等步骤，将微生物分离出来。

5. 最后，对分离得到的维生素K2进行纯化、干燥、包装等处理，即可得到成品。

发酵法生产维生素K2的优点是能够获得更接近天然维生素K2的产物，生物利用度较高，适合用于保健品和药物等领域。

维生素K2的生产技术主要包括合成法和发酵法。

合成法生产工艺简单，适用于大规模生产；而发酵法生产的产物更接近天然维生素K2，生物利用度较高。

根据实际需求和产品要求，可以选择合适的生产方法。

华北制药维生素K2生产工艺A. 工艺流程简介•维生素K2的生产通常采用微生物发酵的方法，主要使用植物源杆菌作为生产菌种。

•工艺包括原料准备、发酵、分离与纯化、产品包装和质量控制等步骤。

B. 原料准备和前处理步骤•原料准备包括培养基的配制、消毒和调节pH值等步骤。

•前处理步骤涉及对发酵产物的预处理，如细胞破碎、固液分离等。

在华北制药维生素K2的生产工艺中，原料准备和前处理步骤是为了确保发酵过程中提供适宜的环境和条件，以促进维生素K2的产生。

以下是原料准备和前处理步骤的一般流程：1. 培养基配制：制备发酵所需的培养基。

培养基通常包含碳源、氮源、矿物质、辅助因子等。

具体的配方和比例会根据维生素K2生产菌株的特性和优化要求进行调整。

2. 消毒：对培养基进行消毒处理，以杀灭其中的微生物和细菌。

消毒可以通过高温灭菌、化学消毒剂或者过滤等方法进行。

3. pH调节：调节培养基的pH值至适宜的范围。

不同的菌株对pH值有不同的要求，通常在发酵前会测量pH值并进行调整。

4. 氧气供应：为发酵提供适当的氧气供应。

氧气对于植物源杆菌的生长和维生素K2的产生非常重要。

可以通过搅拌、增加通气量或使用气体供氧等方法来调节氧气的供应。

5. 营养物质添加：根据维生素K2生产菌株的特性和要求，向培养基中添加适量的营养物质，如碳源、氮源、矿物质和辅助因子等，以提供菌株所需的营养条件。

6. 前处理步骤：在发酵产物进入分离和纯化步骤之前，通常需要进行一些前处理步骤。

这可能包括细胞破碎、固液分离、过滤等，以去除无关物质，净化和浓缩目标产物。

C. 生物发酵过程•发酵是维生素K2生产的核心步骤，需要控制温度、pH值、氧气供应和营养物质的添加等条件。

•发酵过程中，植物源杆菌菌种被加入发酵罐中，通过代谢产生维生素K2。

•发酵时间通常在数天到数周之间，根据菌株特性和工艺优化。

生物发酵是华北制药维生素K2生产工艺中的核心步骤。

在生物发酵过程中，植物源杆菌菌种被加入发酵罐中，通过代谢产生维生素K2。

2020年04月备注：“无沉淀”表示溶液澄清透明，肉眼观察不到水中和瓶底有任何的沉物产生，且与空白样NaCl 、CaCl2溶液对比也观察不到明显沉淀。

由表1可知NaCl 、CaCl2水溶液的浊度值很低。

而合成降滤失剂在NaCl 、CaCl2溶液的浊度值相对比较高。

当降滤失剂溶解到NaCl 、CaCl2水溶液中后，聚合物分子链完全分散在水中，导致整个溶液的浓度和粘度增加，浊度值变大，为十几个NTU 左右，但是肉眼几乎观察不到沉淀存在。

因此，可以初步判断合成的降滤失剂WL2016的抗钙性基本可以达到在20000mg/L 的CaCl2溶液中不会发生反应而产生沉淀，抗盐在200000mg/L 的NaCl 溶液中不会发生反应而产生沉淀。

1.4抗复合盐水性能测试配置基浆，复合盐水基浆：400ml 蒸馏水+4.57%NaCl +0.74%CaCl 2+1.97%MgCl 2+52.5g 钻井液试验用钙膨润土和3.15g 无水碳酸钠，在（24±3）℃下密闭养护24h 作为基浆，其滤失量应在80mL-110mL 范围内。

表2WL-1降滤失剂抗复合盐水性能测试该处理剂在加量0.7%的情况可以将中压滤失量从基浆80ml 降低8.8，降低率达89%，180℃高温热滚后，在1.5%加量下降低到7.2ml ，降低率达91%，该产品在复合盐中具有较好的降失效果。

2现场应用效果针对该处理剂抗温抗盐抗钙特点，优选河南油田含石膏层、芒硝层、碱层等复杂地层的泌阳区块泌432、泌431、泌73-4井进行现场应用试验，在钻穿污染地层，钻井液滤失量增加，加入大量常规降滤失剂效果较差，加入WL-1进行实验。

表3WL-1降滤失剂现场应用情况井号泌73-4泌431泌432污染井深/m 217025002400钻井液体系聚合物防塌抗温抗盐聚磺防塌受污染滤失量变化4.4↑15.4ml 4.8↑8.2ml 5.0↑10.6ml0.3-0.5%W L-1滤失量5.23.84.8通过WL-1在三口井的聚合物防塌钻井液、抗温抗盐钻井液、聚磺防塌钻井液体系中的使用可以看出，WL-1对三种体系都有着很好配伍性，加入0.3-0.5%后滤失量都得到有效降低，能够有效应对多种盐污染下降滤失剂。

维生素k2生产技术维生素K2生产技术维生素K2是一种脂溶性维生素，对人体健康具有重要作用。

它在骨骼健康、心血管保健、血液凝固等方面发挥着重要的调节作用。

维生素K2的生产技术是保证维生素K2质量和产量的关键。

下面将介绍一种常用的维生素K2生产技术。

1. 原料准备维生素K2的常见原料是大肠杆菌（Escherichia coli）。

首先，需要培养大肠杆菌，并提取目标菌株中的维生素K2前体。

2. 发酵培养将维生素K2前体的大肠杆菌菌种接种到含有适当培养基的发酵罐中，进行发酵培养。

培养条件包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。

通过合理调控这些条件，可以提高细胞的生长速度和维生素K2的产量。

3. 维生素K2的提取和纯化发酵液经过离心、过滤等操作，将维生素K2从菌体中分离出来。

然后，通过醇提、溶剂萃取等技术，将维生素K2纯化。

4. 维生素K2的结晶和干燥通过结晶技术，将纯化后的维生素K2结晶出来。

然后，通过干燥技术，将结晶的维生素K2干燥成粉末状。

5. 维生素K2的包装和贮存将维生素K2粉末按照一定的规格进行包装，并进行密封。

然后，将包装好的维生素K2存放在防潮、防光、低温的环境中，以保证其稳定性和保质期。

维生素K2生产技术的关键是控制好发酵条件和纯化工艺。

在发酵过程中，需要根据大肠杆菌的生长特性和维生素K2的合成途径，调控温度、pH值等条件，以提高细胞的生长速度和维生素K2的产量。

同时，还需要保证发酵液的氧气供应和搅拌速度，以保证菌体生长的良好条件。

在维生素K2的提取和纯化过程中，需要进行多次的离心、过滤等操作，以将目标产物分离出来，并去除杂质。

然后，通过溶剂的萃取和醇的提取等技术，将维生素K2纯化。

这些步骤的操作要严格控制条件，以确保维生素K2的纯度和产量。

维生素K2的结晶和干燥是维生素K2生产的最后两个步骤。

通过结晶技术，可以将纯化后的维生素K2从溶液中结晶出来。

然后，通过干燥技术，将结晶的维生素K2干燥成粉末状。

附件 3L-苏糖酸镁等 3 种食品营养强化剂新品种维生素 K 2 （发酵法）英文名称： Vitamin K 2（Fermentation ） 功能分类：食品营养强化剂 （一） 用量及使用范围（二） 质量规格要求 1 范围本质量规格要求适用于以大豆粉、 白砂糖、 葡萄糖经纳豆枯草芽孢杆菌发酵的发酵物， 经提取 精制而成的食品营养强化剂维生素K 2 （发酵法）。

商品化的维生素 K 2 （发酵法）包括：以食用油 为辅料的维生素K 2 （发酵法）油剂和以变性淀粉或糊精、乳化剂、抗氧化剂等为辅料的维生素 K 2 （发酵法）粉剂。

2 分类2.1 维生素K 2 （发酵法）油剂维生素K 2 （发酵法）油剂产品其主要成分为维生素 K 2族的七烯甲萘醌，辅料包括大豆油。

2.2 维生素K 2 （发酵法）粉剂维生素 K 2 （发酵法）粉剂产品其主要成分为维生素 K 2 族的七烯甲萘醌，辅料含变性淀粉、淀 粉、糊精、微晶纤维素、乳化剂、抗氧化剂等。

3 分子式、结构式和相对分子质量 3.1 分子式C 46H 64O 23.2 结构式3.3 相对分子质量649.00 （按2007年国际相对原子质量）食品分类号01.03.02食品类别（名称）调制乳粉（仅限儿童用乳粉） 调制乳粉（仅限孕产妇用乳粉）使用量420μg/kg~750μg/kg 340μg/kg~680μg/kg4 技术要求4.1 感官要求： 应符合表1的规定。

表1 感官要求4.2 理化指标： 应符合表 2 的规定。

表 2 理化指标4.3 微生物指标： 应符合表 3 的规定。

表3 微生物指标5 其他要求项 目菌落总数/(CFU/g)霉菌和酵母/(CFU/g) 大肠菌群/(MPN/g)大肠埃希氏菌/(MPN/g) ＜ 致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）指 标（若非指定，均以/25g 表示）维生素K 2 （发酵法） 维生素K 2 （发酵法）油剂300 25粉剂1000100 3.0 3.0 不得检出检验方法GB 4789.2 GB 4789.15 GB 4789.3 GB 4789.38GB 4789.4、GB 4789.10≤ ≤ ＜项 目维生素 K 2 的含量 a /（µg/g）酸价/（mg KOH/g ） 过氧化值/（meq /kg ） 水分，w/% 灰分，w/%总砷（以 As 计） /(mg/kg)铅（Pb)/(mg/kg) 汞（Hg ） /(mg/kg)镉（Cd ） /(mg/kg) 六六六/(mg/kg) 滴滴涕/(mg/kg)黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2） /（µg/kg指 标维生素K 2 维生素K 2（发酵法）油剂 （发酵法）粉剂 ≥ 1500 1000 ≤ 1.0 - ≤ 5.0 - ≤ - 5.0 ≤ - 3.0 ≤ 0.1 ≤ 0.1 ≤ 0.05 ≤ 0.1 ≤ 0.05 ≤ 0.05 ≤ 5.0检验方法附录 A 中 A.4 GB/T 5009.37 GB/T 5009.37 GB 5009.3 GB 5009.4 GB 5009.11 GB 5009.12 GB 5009.17 GB 5009.15 GB/T 5009.19GB/T 5009.23）项目 色泽 滋味、气味 性状 杂质要求维生素K 2 （发酵法）粉剂白色至浅黄色本品特有的气味、滋味，无异味澄清或微混浊油状 粉末状无正常视力可见的杂质检验方法取样品适量置于50mL 烧杯中， 于自然光下，用肉眼观察其色 泽、形态、组织、杂质，嗅其 气味。

附件3L-苏糖酸镁等3种食品营养强化剂新品种维生素K2（发酵法）英文名称：Vitamin K2（Fermentation）功能分类：食品营养强化剂（二）质量规格要求1 范围本质量规格要求适用于以大豆粉、白砂糖、葡萄糖经纳豆枯草芽孢杆菌发酵的发酵物，经提取精制而成的食品营养强化剂维生素K2（发酵法）。

商品化的维生素K2（发酵法）包括：以食用油为辅料的维生素K2（发酵法）油剂和以变性淀粉或糊精、乳化剂、抗氧化剂等为辅料的维生素K2（发酵法）粉剂。

2分类2.1 维生素K2（发酵法）油剂维生素K2（发酵法）油剂产品其主要成分为维生素K2族的七烯甲萘醌，辅料包括大豆油。

2.2 维生素K2（发酵法）粉剂维生素K2（发酵法）粉剂产品其主要成分为维生素K2族的七烯甲萘醌，辅料含变性淀粉、淀粉、糊精、微晶纤维素、乳化剂、抗氧化剂等。

3 分子式、结构式和相对分子质量3.1分子式C46H64O23.2 结构式3.3 相对分子质量649.00（按2007年国际相对原子质量）4 技术要求4.1 感官要求：应符合表1的规定。

表1 感官要求4.2 理化指标：应符合表2的规定。

表2 理化指标4.3 微生物指标：应符合表3的规定。

表3 微生物指标5 其他要求产品应装于适宜的避光容器中充氮或真空保存，产品的最佳保存温度为20℃以下。

附录A检验方法A.1 安全提示本质量规格要求试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，按相关规定操作，操作时需小心谨慎。

若溅到皮肤上应立即用水冲洗，严重者应立即治疗。

在使用易燃品时，严禁使用明火加热。

A.2 一般规定本质量规格要求所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的一级水。

试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。

试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。