大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的代谢工程研究

大肠杆菌高得率合成琥珀酸的系统代谢工程研究琥珀酸是一种重要的平台化合物,琥珀酸及其衍生物被广泛地应用于食品、医药和化工等领域。

大肠杆菌是目前生产琥珀酸的主要菌株。

然而由于胞内NADH的供应不足,大肠杆菌经TCA还原臂生成琥珀酸的最大理论得率被限制为1 mol/mol葡萄糖。

本文首次计算并报道出当磷酸戊糖(PP)途径和糖酵解途径的碳流量比为6:1时,琥珀酸能实现其最大理论得率1.714mol/mol葡萄糖。

基于这个理算计算,我们战略性地调控了产琥珀酸的多条途径。

系统的代谢工程策略,包括过表达氧化PP途径的关键基因,强化葡萄糖的运输效率,过表达羧化途径的关键酶,以及强化琥珀酸胞内到胞外的运输,琥珀酸的得率提高到1.54mol/mol葡萄糖,相比出发菌株ZTK提高了52%,达到理论最大得率的90%。

来自谷氨酸棒杆菌的解调基因zwf243-gnd361被首次引入大肠杆菌的琥珀酸生产菌株ZTK。

通过比较过表达大肠杆菌自身的zwf-gnd和谷氨酸棒杆菌的突变基因zwf243-gnd361对琥珀酸得率及胞内NADH/NAD+的影响,发现过表达来自谷氨酸棒杆菌的解调基因zwf243-gnd361能有效地提高胞内NADH的水平,促进琥珀酸的合成。

进一步过表达了PP途径的关键基因pgl、tal B和tktA,琥珀酸的得率提高到1.21 mol/mol葡萄糖。

引入产琥珀酸放线杆菌的pepck,过表达大肠杆菌自身的sthA,敲除乙酸形成基因ackA-pta,菌株WSA150琥珀酸得率提高到1.36 mol/mol葡萄糖。

在菌株WSA150的基础上,过表达葡萄糖运输途径的基因galp,菌株的比糖耗速率提高了12%。

过表达来自谷氨酸棒杆菌的pyc,副产物丙酮酸的积累量减少将近一半,琥珀酸的得率提高到1.40 mol/mol葡萄糖,达到理论最大得率的82%。

我们进一步强化厌氧条件下的四碳二羧酸运输蛋白的表达量从而去提高琥珀酸的得率。

专利名称：一株产琥珀酸的菌株及其生产琥珀酸的方法和应用专利类型：发明专利
发明人：赵新河,任晓洁
申请号：CN202210320375.0
申请日：20220329
公开号：CN114621897A
公开日：
20220614
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株产琥珀酸的菌株及其生产琥珀酸的方法和应用。

所述菌株的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SUC37，其保藏号为CGMCCNo.24150，通过中试验证，其发酵产酸可达到80g/L，基于消耗葡萄糖的分子转化率达到110％以上，该技术同时具有了高转化率，低能耗，低过程控制成本的优良特征，已经达到琥珀酸发酵的国际先进水平。

申请人：山东理工大学
地址：255000 山东省淄博市张店区新村西路266号
国籍：CN
代理机构：西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：崔瑞迎
更多信息请下载全文后查看。

科技成果——集成化固定二氧化碳和生产琥珀酸成果简介琥珀酸是直链饱和二元羧酸，为重要的化工原料，可以合成1,4-丁二酯、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸等，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工业。

近年来，由于不断开拓新的应用领域，琥珀酸的需求猛增。

利用微生物发酵生产琥珀酸是以可再生资源取代石油生产的一种绿色平台化学技术。

同时发酵法生产琥珀酸过程中需要CO2，将发酵生产琥珀酸与CO2的生物固定过程进行偶合，更有可能将乙醇发酵过程中的CO2或者其他行业的含CO2废气加以利用，开辟了温室气体利用的新途径，从长远利益来讲有利于减缓全球变暖和能源危机。

本项目利用代谢工程大肠杆菌进行琥珀酸发酵，通过发酵过程的相关调控，显著提高琥珀酸的合成和对葡萄糖的得率。

同时设计了特殊的反应器，提高了二氧化碳的固定效率，实现了有效的琥珀酸生产和二氧化碳固定。

主要参数琥珀酸浓度：59g/L；葡萄糖转化率：1.24mol/mol；生产强度：1g/L/h。

主要创新和技术优势1、利用廉价培养基实现琥珀酸的高效生产，过程简单，产量和生产强度较高，葡萄糖转化效率高；2、固定CO2效果良好，可与乙醇发酵或其它释放CO2的工艺有效偶联，减少CO2排放，并进一步降低成本；3、副产物少，提取方便。

所属领域化工、能源、材料项目成熟度小试应用前景目前，世界琥珀酸的市场总量为16万吨左右，年销售额超过4亿美元，预计未来十年将以10%速度增长。

世界上琥珀酸生产主要有传统的化学法和现代生物法，其中以玉米为原料，采用生物法生产琥珀酸代表未来发展方向。

日本三井公司于上世纪90年代采用生物酶转化法生产琥珀酸，美国应用碳化学公司于2002年采用生物发酵法生产琥珀酸，生产规模为年产5000吨，生产技术为国际领先水平，成本价每吨2200美元，目前是全球生产成本最低的。

据美国咨询中心测算，若采用此生产工艺，生产规模扩至年产7.5万吨，成本价将降至每吨550美元。

化工进展Chemical Industry and Engineering Progress2023 年第 42 卷第 8 期代谢工程改造微生物合成生物基单体的进展与挑战高聪，陈城虎，陈修来，刘立明（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）摘要：单体是合成聚合物所用的小分子基础原料，目前主要来源于化石燃料。

利用微生物制备生物基单体具有生产条件温和、环境友好、可持续的优势，是实现高分子材料行业绿色制造的重要途径。

借助代谢工程和合成生物学元件，目前已经实现了多种单体的微生物制造，然而与石油基生产工艺相比，这些单体微生物细胞工厂的生产性能普遍较低。

围绕代谢工程改造微生物合成生物基单体过程中存在的瓶颈问题，本文基于具体案例分析，从廉价底物的高效利用、提高生物基单体合成效率、强化细胞环境耐受性三个方面，总结了改造微生物合成单体的最新研究进展。

同时，讨论了单体微生物细胞工厂目前存在的挑战和未来发展方向。

关键词：微生物细胞工厂；塑料单体；底物利用；调控策略；环境耐受性中图分类号：Q815; TQ92 文献标志码：A 文章编号：1000-6613（2023）08-4123-13Progress and challenges of engineering microorganisms to producebiobased monomersGAO Cong ，CHEN Chenghu ，CHEN Xiulai ，LIU Liming(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)Abstract: Monomers are the basic raw materials used in the synthesis of polymers, which mainly come from fossil fuels. Engineering microorganisms to synthesize monomers has the advantages of mild production conditions, environmental friendliness, and sustainability, which is an important way to achieve green manufacturing in the material industry. With the help of metabolic engineering and synthetic biology parts, microbial manufacturing of various monomers has been realized at present. However, compared with petroleum-based production processes, the production performance of these microbial cell factories is limited. Focusing on the bottleneck problems in engineering microorganisms to synthesize bioplastic monomers, this review summarizes the latest research progress in the metabolic engineering of microorganisms to produce monomers from three aspects: efficient utilization of cheap substrates, improvement of monomer synthesis efficiency, and enhancement of cell environment tolerance,based on specific case studies. At the same time, the current challenges and future direction of the microbial monomer cell factory are discussed.Keywords: microbial cell factories; bioplastic monomer; substrate utilization; regulation strategy;environmental tolerance特约评述DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2023-0289收稿日期：2023-02-28；修改稿日期：2023-04-08。

大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建进入21世纪,随着环境污染和石油资源的日益枯竭,可持续发展已经深入人心。

而工业微生物作为可持续发展的一个重要支撑,是解决资源危机、生态环境危机以及改造传统产业的关键所在。

目前,工业微生物技术已经渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域,并扮演着越来越重要角色。

而代谢工程已经发展成为一种最有力的优化微生物代谢途径、提高微生物目标产物生产能力的工具。

大肠杆菌作为一种研究最透彻的模式微生物具有无可比拟的优越性：遗传背景清晰、易操作、生长迅速、营养要求简单等。

因此,通过基因工程改造大肠杆菌发酵生产重要的工业产品,实现工业原材料来源的根本转变具有重要意义。

本研究首先在分析了大肠杆菌基因表达调控方式的基础上,构建了一种环境压力诱导型的表达系统。

该系统不依赖于人为诱导剂的添加,当菌体进入对数生长期后期,该系统被诱导并转录下游基因。

在分析该表达系统的特点后,我们成功将该系统应用于聚羟基丁酸酯(PHB)的发酵生产中。

发酵结果显示工程菌株DH5α(pQKZ103)在不添加任何诱导剂的条件下积累菌体干重、PHB浓度以及PHB含量分别为4.1 g/L、3.52 g/L和85.8 wt%；而对照菌株DH5α(pBHR68)在添加0.1mM IPTG诱导后,菌体干重、PHB浓度及PHB含量分别为2.3 g/L,0.98g/L和42.6 wt%。

显然,本研究所构建的环境压力诱导型表达系统明显优于IPTG诱导系统。

在构建了环境压力诱导型表达系统后,我们具体针对大肠杆菌葡萄糖中心代谢进行了分析。

在大肠杆菌发酵葡萄糖生产重组蛋白以及化工原料时,如何解决乙酸分泌问题一直受到大家的关注。

大约30%的葡萄糖流向了乙酸的生成,不仅造成了浪费,同时,乙酸的积累对菌体的生长造成了巨大的毒害。

在系统分析葡萄糖代谢的基础上,我们采用基因敲除的方法,对大肠杆菌中乙酸相关基因ptsG、poxB、pta以及iclR进行缺失,分析每个基因对乙酸积累的影响。

好氧—厌氧产琥珀酸大肠杆菌的构建及全阶段发酵设计的研究琥珀酸是一种重要的平台化合物,位于美国能源部选出的12种(组)具有高附加值的平台化合物之首。

作为兼性厌氧菌,现有的利用大肠杆菌工程菌株生产琥珀酸的策略有三种：好氧生产、厌氧发酵和好氧生长-厌氧发酵两阶段法等。

鉴于这三个琥珀酸发酵策略的优势与瓶颈,我们构建了一株在好氧、微好氧、及厌氧条件下均生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株,并开发了好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵策略。

解除低溶氧对琥珀酸好氧产生途径的抑制。

通过在好氧产琥珀酸菌株QZ1111中敲除氧气感应系统ArcAB中ArcA组分的编码基因arcA,获得工程菌株QMJ03。

QMJ03的琥珀酸产量提高81.65%,副产物乙酸的分泌量下降60%。

QMJ03在对数生长期保持一个几乎恒定的琥珀酸产生速率。

在溶氧较低的对数生长后期,QMJ03中TCA循环和乙醛酸支路等途径中相关基因较QZ1111均上调。

arcA基因的敲除解除了低溶氧对好氧琥珀酸产生途径中相关基因的抑制,有利于微好氧条件下琥珀酸的积累。

提高工程菌株厌氧产琥珀酸能力。

通过敲除大肠杆菌厌氧混合酸发酵中NADH利用的两条代谢支路一乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶,得到工程菌株QMJ09。

QMJ09的厌氧琥珀酸产量较QMJ03提高了2.5倍,而二者好氧琥珀酸产量相当。

这样,我们成功构建了一株好氧-厌氧产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株。

再分配代谢流提高厌氧琥珀酸得率。

通过在QMJ09基因组上对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因(pckA)的启动子进行了点突变(YL102)和在质粒上过量表达NAD+依赖的苹果酸酶(pSCsfcA),以增加磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的羧化流量。

厌氧阶段的琥珀酸得率由0.95mol/mol Glucose (QMJ09)提高到1.35mol/mol Glucose (YL102/pSCsfcA)。

加快葡萄糖的跨膜运输提高琥珀酸产量和生产强度。

组成型表达具有高速率、低能耗的运动假单胞杆菌来源的葡萄糖运输载体GlfZm的编码基因(trc-rbs-glfZm),并整合到QMJ09和YL102的基因组上,分别获得工程菌株YL104和YL106,进而获得重组菌株YL104/pSCsfcA和YL106/pSCsfcA。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011181369.9(22)申请日 2020.10.29(83)生物保藏信息CCTCC NO.M 2020454 2020.08.27(71)申请人 江南大学地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号(72)发明人 刘立明　唐文秀　徐祖伟　罗秋玲　陈修来　高聪　刘佳　(74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257代理人 王玉仙(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12P 7/46(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用(57)摘要本发明公开了一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

本发明提供一株大肠杆菌，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME ‑N ‑5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。

本发明的大肠杆菌FMME ‑N ‑5在厌氧摇瓶水平上发酵52h，生产琥珀酸产量达56.77g/L，在发酵罐水平上发酵96h ，琥珀酸产量达105.2g/L ，之前选育菌株FMME ‑SuAP菌株罐上发酵55h，琥珀酸产量80g/L，但是因不能耐受高浓度产物，延长发酵时间，琥珀酸产量不再增加；而本发明诱变选育菌株FMME ‑N ‑5对产物丁二酸钠的耐受性提高，最终琥珀酸产量提高至105.2g/L；本发明发酵生产琥珀酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 112239738 A 2021.01.19C N 112239738A1.一株产琥珀酸的大肠杆菌，其特征在于，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME -N -5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。