液体单试剂检测血氨方法的建立

年所致。

此外,胃酸减少,甲状腺素分泌减少也影响铁的吸收,也是造成缺铁性贫血的原因。

另有4例患者,H b虽然正常,处于低值下限,但M CV已大于100fl,有发生贫血的趋势,也应引起足够重视,应及早干预治疗。

从以上分析可以看出,甲减引起的贫血多为轻、中度,H b 很少低于80g/L。

甲状腺素减少引起贫血的机制复杂,常为几种因素综合作用的结果,造成贫血的类型多种多样,分别有各自的实验室检查特点,没有一定的规律可循。

其多数起病隐匿,发展缓慢,临床表现多为无特异性的症状,有些患者贫血症状可被甲减症状掩盖,有些患者甲减症状可被贫血症状掩盖;不少患者有久病后心肌纤维肿胀,黏液性糖蛋白(PA S染色阳性)沉积以及间质纤维化,引起甲减性心肌病变、脑血管疾病及其他内分泌疾病,使临床表现更为复杂和不典型,为疾病的早期诊断带来一定的困难。

因此,在临床工作中应详细询问病史和进行体格检查,分析病情变化时应放开思路,做实验室检查时应周到和有针对性。

骨髓象和血常规中H b、M CV、M CH、M CHC、W BC的测定对甲减性贫血患者的诊治具有重要的意义。

参考文献1廖煜,张秋玲.甲状腺功能减退伴神经系统病症误诊分析[J].临床内科杂志,2005,22(8):564.(收稿日期:2007-12-29)临床研究液体单试剂检测血氨方法的建立杨小兵,陈敬捷,徐晓慧(广西壮族自治区龙潭医院检验科,广西柳州545005)=摘要>目的配制液体单试剂,建立酶两点动力法测定血浆中血氨含量。

方法在荷兰威图科学公司DPU-41型半自动生化仪和美国贝克曼公司CX5-CE型全自动生化仪上研究酶两点动力法,建立实验参数。

结果试剂含量:三乙醇胺缓冲液(pH7.4)0.25mol/L,A-酮戊二酸15mmo l/L,还原型辅酶0.3mmo l/L,谷氨酸脱氢酶大于160U/L。

该法最低检出限为1.9L mo l/L,线性范围达321L mol/L(r=0.9961),批内CV=2.2%,批间CV= 4.4%,平均回收率=99.3%,胆红素<175.8L mo l/L,血红蛋白<3.4g/L,对测定结果无显著影响。

结论本法灵敏度高,线性、精密度好,结果准确,胆红素、血红蛋白干扰小,操作简便,适用于全自动及半自动生化分析仪,可推广运用。

=关键词>血氨;液体单试剂;酶两点动力法中图分类号:R446文献标志码:A文章编号:1672-9455(2008)08-466-02血氨增高是肝性脑病临床特征之一,其准确检测有助于诊断肝性脑病、儿科Reye综合征。

血氨在体内主要以NH4+和NH3两种形式存在,血液中血氨主要来自肠道产生的氨及肾脏分泌的氨。

其测定方法有多种,如扩散法、去蛋白波氏比色法、离子交换层析法、氨电极法、酶法、干化学法等[1]。

但扩散法及波氏比色法灵敏度低,准确性及精密度不佳;离子交换层析法需长时间处理;氨电极法准确性和精密度较好,但稳定性受多种因素影响,尚难普及使用;干化学法可用在半自动生化仪上,但手工操作过程增加了干扰因素链,且干粉试剂溶解后有效期短,难以控制测试的准确性和精密度,加上血氨测定样本少,使测试成本增高。

因此,寻找一种更准确、灵敏、简便、经济的测定血氨的方法具有实际意义,笔者拟在半自动、全自动生化仪上建立液体单试剂酶两点动力法测定血氨,结果准确,现报道如下。

1材料与方法1.1仪器荷兰威图DP U-41型半自动生化仪;美国贝克曼CX5-CE型全自动生化仪。

1.2试剂(1)试剂成分含量:三乙醇胺缓冲液(pH7.4)0.25 mol/L,A-酮戊二酸15mmol/L,还原型辅酶(N AD H)0.3mmol/L,谷氨酸脱氢酶(GL DH)>160U/L,二磷酸腺苷1.5 mmol/L。

(2)无氨蒸馏水制备:利用进口美国贝克曼公司离子交换柱产生无氨蒸馏水。

(3)氨标准液(7mmol/L)制备:准确称取干燥硫酸氨462.5mg,溶于无氨蒸馏水,再移入1000mL 容量瓶中,并加无氨蒸馏水至刻度。

1.3原理N H4++A-酮戊二酸+N A DHGLDHL-谷氨酸+N AD++H2O。

N A DH消耗速率与N H4+浓度成正比,在340nm处连续监测吸光度的变化率(v A/min)。

1.4实验参数(1)方法:液体单试剂酶两点动力方法(连续监测,速率1)。

(2)反应温度:37e。

(3)样本40L L,试剂200 L L,反应方向向下。

(4)延迟时间:30s。

(5)读空白时间:280s 开始,300s结束。

(6)连续监测时间:60s,计算出吸光度降低的速率时间(v A/min)。

(7)波长:主波长340nm,次波长410 nm。

(8)计算公式如下:N H4+(L mo l/L)=v A/min1(240@ 10)/(6220@40@0.5)2(注:0.5为CX5生化仪比色杯光径,半自动比色杯光径为1.0)。

1.5统计学处理实验数据的统计学处理采用SPSS10.0统计软件,样本均数采用t检验。

2结果2.1反应进程及曲线试剂与样本混合后,在340nm处连续监测吸光度4min,依仪器数据显示连续监测180s内线性最佳,取线性最佳的一段,设定延迟时间为30s,测定时间为60s。

2.2最适pH范围实验溶液的最终pH范围7.0~7.8(采用日本拜尔公司850血气分析仪检测),其他条件(温度、时间、酶含量和底物浓度)相同,对1份血氨标准液(58.8L mo l/L,北京中生产品)进行检测,结果显示,实验溶液pH值越接近7.4时酶促反应越大,测定值越真实。

2.3GL DH用量选择试剂中GL DH的活性浓度分别为80、120、160、200、240U/L,其他条件不变,测定1份血浆样本的血氨浓度来观察GL DH适合浓度。

结果显示,试剂中GL DH的活性为160U/L时反应曲线已趋平坦,故确定试剂中GL DH的活性浓度为160U/L。

2.4试剂的稳定性试剂配制后,立即在340nm测定吸光度A=1.212,每天测定1次,当A<0.900时,表明试剂失效,结果显示试剂稳定有效期为90d以上。

2.5线性实验使用混合患者血浆制备5个水平浓度样本,制备混合血浆准备如下[2]:低浓度V1混合血浆,高浓度V5混合血浆;血浆V2=3份/V10+1份/V50;血浆V3=2份/V10+2份/V50;血浆V4=1份/V10+3份/V50。

配制的标本浓度按公式标本浓度=(X1@V1+X5@V5)/(V1+V5)计算,在同一工作日内完成测定工作,每个浓度标本重复测定4次,计算平均值,记录结果。

通过判断离群点,结果显示,血氨线性可达321 L mol/L,Y=3.466X+0.88,r=0.9995。

2.6精密度实验取1份血浆样本分别作批内、批间测定20次,批内:x=38.5L mo l/L,s=0.88,CV= 2.2%,批间:x= 36.7,s=1.62,C V=4.4%。

2.7参考值取健康人清晨空腹血样60例,男、女各半,采用肝素锂抗凝剂,年龄14~45岁,用本方法测定血氨水平,以(x ?1.96s)作参考范围。

结果男、女差异无统计学意义,参考范围:10.5~44.8L mol/L。

2.8回收实验在1份血浆样品中,分别加入高、中、低3种浓度的氨标准液(自配),同时血浆样品中加入相同体积的无氨蒸馏水做基础样品,每份样品重复测定3次,结果取平均值,计算回收率。

回收率分别为97.6%、98.9%、101.4%,平均回收率99.3%。

2.9最低检出限采用5L mol/L的氨标准液作最低检出限测定,重复测定10次,求出标准差,以3s为最低检出限,结果为1.9L mo l/L。

2.10干扰实验在1份血氨含量为55.8L mo l/L的血浆样品中,分别加入不同含量的胆红素、血红蛋白,同时以样品中加入相同体积的无氨蒸馏水作基础样品。

结果表明,胆红素小于175.8L mol/L,血红蛋白小于3.4g/L时对本法测定结果无显著影响。

3讨论3.1从结果中看出,pH越接近7.4,测定值越能反映样本中真实血氨的浓度;越偏离7.4,结果偏低。

主要原因是血液中游离氨以N H4+和N H3两种形式存在,使两种形式的总量处于平衡状态。

在pH值7.4时,98%以N H4+形式存在,因此,维持试剂溶液的pH值为7.4,保证了血氨测试的准确性及稳定性。

3.2抽样时应用肝素抗凝剂,肝素能抑制腺苷脱氨酶,以减少采血后体外生成氨[3],不宜用枸橼酸钠抗凝剂,枸橼酸钠抗凝剂分解出H+离子,从而使血氨测定值偏高。

现对20例患者用两种不同抗凝剂(一种是肝素锂,一种是枸橼酸钠)进行抽样,3000r/min离心10m in,同时测定血氨浓度,结果显示,枸橼酸钠抗凝管的血氨浓度平均偏高82个单位。

3.3目前使用的血氨干粉酶法试剂盒的参数不符合全自动生化分析仪[4],用半自动生化分析仪进行分析,干扰因素太多,加样器、试管、溶剂等因素都对血氨结果产生正干扰,且干粉试剂溶解后使用有效期短。

为克服此缺点,使血氨实验真正适合全自动和半自动分析,对试剂配方进行研究发现,血氨测试是否准确,试剂中G LDH酶活力的稳定十分关键,添加50%甘油能有效提高GL DH酶的稳定性,同时在试剂中加入一些EDT A-N a,防止金属离子的干扰,有效提高试剂的有效期,使之完全符合全自动生化仪的参数设置。

3.4样本采集后应立即进行检测,如不能送检应低温保存,低温保存能抑制C-谷氨酰转移酶、转氨酶学的活性[5],在测试过程中,交叉污染及环境等因素会影响试剂中酶的活力,加上标本测试较少,因此,上机试剂装载量不宜配制过多[6],以本科室工作量适当配制,同时做好室内质量控制,发现失控时即可更换试剂,保证结果的可靠性。

参考文献1钱均.临床生物化学和生物化学检验实验指导[M].第2版.北京:人民卫生出版社,2003.56.2申子瑜.医院管理学)))临床实验室管理分册[M].北京:人民卫生出版社,2005.203.3李影林.临床医学检验手册[M].长春:吉林科学技术出版社,1987.431.4石寅皓.全自动生化分析仪限额参数的设置[J].临床检验杂志,1998,16(2):95-96.5宋立兴,李时芳,黄之方.不同厂家肝素对血氨测定结果的影响[J].四川省卫生管理干部学院学报,2003,22(2):94. 6叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京:东南大学出版社,1997.235.(收稿日期:2008-01-09)。