ISO6579食品和动物饲料微生物学沙门氏菌检测

ISO 6579 ：2002 食品和动物饲料微生物学—沙门氏菌检测序ISO 是国际标准的全球性组织。

准备国际标准这项工作通常由ISO 技术联盟来完成。

每一个团体成员负责各自的学科。

与ISO 有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。

ISO 与国际电子组织( IEC)在电子标准化方面有着密切的合作关系。

国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。

起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。

发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。

由于某些学科涉及到专利权。

而ISO 没有责任去鉴别这些专利。

ISO 6579 是ISO/TC 34 起草的。

这个第四版取代了第三版( ISO 6579:1993)，由于它在技术上已经落后了。

附录A 和B 是本标准的标准化部分。

附录C 只为了提供信息。

绪论由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。

在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。

否则，要尽可能地完全遵循本标准。

当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。

同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。

希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。

警告——为了保护实验室人员的安全，必须确保沙门氏菌的检测，特别是伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，必须在一个有经验的微生物学家的指导下，在适当的实验室设备中进行，并处理好实验室废弃物。

1 范围这个国际标准主要提供沙门氏菌的检测方法，包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。

局限性已在绪论中给出，本标准适用于——用于人类消耗和动物饲养的产品；——食品生产和食品加工的环境样品。

警告——本方法可能不能复苏所有的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。

2 参考标准以下标准文件是本标准的参考标准。

已过期的文献，后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。

然而，有大部分学者正在争取发布最新版的文献如以下列出。

对于无限期的文献，最新版本都是适用的。

ISO和IEC成员保存当前有效国际性标准的记录。

ISO 6887-1，食物与动物饲料原料微生物学——样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释——第一部分：样品原液和十倍法稀释的指导准则。

ISO 7218，食物与动物饲料原料微生物学——微生物检验指导准则。

ISO 8261，牛奶和奶制品——微生物检测样品准备、品原液和十倍法稀释的指导准则。

3 术语和定义以下术语和定义适用于本标准。

3.1沙门氏菌按照本国际标准操作，在固体选择性培养基上形成典型或略典型的菌落，并且生物学反应和血清学反应符合要求。

3.2检测沙门氏菌按照本国际标准操作，检查一定重量或体积的样品存在或不存在沙门氏菌。

4 原理4.1概述沙门氏菌的检测有四个必须的连续阶段（也可见附录A ）。

注意：沙门氏菌可能以很少数量存在，并伴随大量的肠杆菌属或其它属细菌存在。

此外，检测低数量的受损的沙门氏菌，前增菌是必要的。

4.2使用非选择性液体培养基前增菌缓冲蛋白胨水环境温度培养是检测的一部分，然后37℃±1℃培养18h±2h。

对于特定的食品，使用其它的前增菌是必要的（见9.1.2）。

如果是大量的样品，在接种前，缓冲蛋白胨水必须先预热至37℃±1℃。

4.3选择性液体培养基中增菌使用RV大豆培养基（RVS肉汤）和MK 连四硫酸盐/新生霉素（MKTTn 肉汤）肉汤。

RVS肉汤41.5℃±1℃，24h±3h。

MKTTn 肉汤37℃±1℃，24h±3h。

4.4平板划线和鉴定使用两种选择性固体培养基：——木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD 琼脂）；——任何对XLD 琼脂做补充的固体选择性培养基，并能分离乳糖阳性的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。

实验室可以自己选择使用哪一种培养基。

XLD 琼脂37℃±1℃培养24h±3h。

另一种培养基根据生产商的要求培养。

注意：如亮绿琼脂（ BGA ），亚硫酸铋琼脂可供选择。

4.5确认试验假定沙门氏菌菌落进行次培养，做适当的生化学和血清学试验来鉴定。

5 培养基和试剂、血清5.1概述一般实验室实践，参照ISO 7218。

5.2常规培养基和试剂注意：由于需使用到大量的培养基和试剂，其成分和准备查看附录B。

5.2.1非选择性钱增菌培养基：缓冲蛋白胨水见B.1。

5.2.2第一个选择性增菌培养基：RV大豆培养基（RVS 肉汤）见B.2。

5.2.3第二个选择性增菌培养基：MK 连四硫酸盐/新生霉素（MKTTn 肉汤）肉汤见B.3。

5.2.4固体选择性平板培养基5.2.4.1第一个培养基：木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD 琼脂）见B.4。

5.2.4.2第二个培养基第二种适当的培养基的选择取决于试验室的判断。

必须按照生产商的要求配5.2.5营养琼脂见B.5。

5.2.6三糖铁琼脂（TSI琼脂）见B.6。

5.2.7尿素琼脂（西蒙氏）见B.7。

5.2.8L－赖氨酸脱羧酶培养基见B.8。

5.2.9牛乳糖检测试剂见B.9。

5.2.10VP反应试剂见B.105.2.11吲哚反应试剂见B.11。

5.2.12半固体营养琼脂见B.12。

5.2.13生理盐水溶液见B.13。

5.3血清一般可买到含有一种或多种O抗原的血清。

例如：抗体血清包含一种或多种“O，”称为单价或多价“O”抗体血清，“Vi血”清。

还有包含一种或多种H抗原的血清。

必须确认所使用的血清适合检测所有类型的沙门氏菌。

6 设备和玻璃器皿使用一般微生物实验室设施（见ISO 7218）,另有以下增加。

6.1干热灭菌或湿热灭菌设备见ISO 7218。

6.2干燥箱或烘箱，鼓风式，能达到37℃～55℃6.3培养箱，可恒温37℃±1℃6.4水浴锅，可恒温41.5℃±1℃6.5水浴锅，可恒温44℃～47℃6.6水浴锅，可恒温37℃±1℃6.7接种环，直径3mm6.8pH计6.9试管或三角瓶6.10刻度移液管或移液器，10ml和1ml6.11平皿，小尺寸的（直径90mm～100mm）和大尺寸的（直径140mm）7 取样ISO 6888 中并不涉及取样。

如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。

微生物实验室接收到的样品必须是真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。

8 样品前处理参照样品的相关国际标准进行前处理。

如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。

9 程序9.1测试部分和样品原始悬液9.1.1概述参照ISO 6887-1，相关细节可参考各个样品的标准。

牛奶或奶制品参照ISO 8261。

样品原始悬液的准备，一般使用钱增菌培养基。

如果取样量大于25g，使用前增菌培养基补足至1:10 悬液。

当不只一份25g 的样品进行检测时，为了降低检测工作量，并且合成物不会影响样品的检测，可以将多个检测部分合成为一个部分。

例如，如果有十份25g 的样品检测，可以把这十个样品合成成为一份250g 的样品，添加2.25L 前增菌肉汤。

可以选择，将0.1ml（在10mlRVS 肉汤中）和1ml（在10mlMKTTn 肉汤中）的前增菌肉汤合并为一份，添加至100ml 选择性培养基中。

9.1.2特殊食物样品原始悬液的准备注意：以下操作只用于沙门氏菌的检测。

详细的细节可参照ISO 6887-2，ISO 6887-3 ，ISO 6887-4 和 ISO 8261 。

9.1.2.1可可粉和含有可可粉的产品（大于20％）加入含50g/l 酪蛋白的缓冲蛋白胨水（避免使用酸酪蛋白），或100g/l 灭菌脱脂奶粉，培养2h后，如果样品中含有大量的革兰氏阳性菌群，添加0.018g/l 亮绿。

9.1.2.2酸性和变酸食品要确保前增菌过程中pH 值不会低于4.5。

注意：如果使用双倍浓度缓冲蛋白胨水水会使酸性和变酸食品的pH 值比较稳定。

9.2非选择性前增菌将原始悬液在37℃ ±1℃下培养18h±2h。

9.3选择性增菌9.3.1接种0.1ml 9.2中的培养物至10ml RVS 肉汤；接种1ml 9.2中的培养物至10ml MKTTn 肉汤。

9.3.2RVS肉汤41.5℃±1℃下培养24h±3h；MKTTn 肉汤37℃±1℃下培养18h±3h。

必须检查培养温度不能超过限值42.5℃。

9.4划线平板并鉴别9.4.1培养24h±3h后，取一环RVS 肉汤培养物划线至大尺寸的XLD 平板，以便能很好的分离出单个菌落。

如果没有大尺寸的平板，使用两个小尺寸平板代替。

同样划线第二种选择性固体培养基。

9.4.2培养24h±3h 后，取一环MKTTn 肉汤，重复9.4.1 操作划线两种选择性平板。

9.4.3倒置平板，放置于培养箱中。

XLD 平板37℃培养，第二种培养基培养温度参照生产商要求。

9.4.4培养24h±3h 后，检查是否存在典型的沙门氏菌菌落，或不典型的可能为沙门氏菌的菌落。

XLD 平板上的典型沙门氏菌菌落为黑色中心，周围有一圈微红色的透明圈，由于培养基的指示剂。

注意：H2S 阳性沙门氏菌为粉红色中心深粉红色。

乳糖阳性沙门氏菌为黄色有或没有黑色中心。

按照生产商的要求培养第二种培养基，检查有没有典型菌落出现。

9.5证实9.5.1概述商业的沙门氏菌生化鉴定盒如果确认可靠，即可供使用。

生化鉴定盒的使用涉及到菌落的生化特性确认。

必须按照生产商的说明使用。

注意：沙门氏菌菌落的辨别需要很大深度的经验，不仅是逐个逐个血清型，而且是一批批选择性培养基的使用。

9.5.2挑选菌落做确认每个选择性平板至少挑选一个典型菌落或疑是菌落做确认，如果第一个菌落为阴性，必须重新挑选四个菌落。

流行病学研究一般会挑选五个菌落。

如果平板上少于五个典型或疑是菌落，挑选所有菌落做确认。

将挑选的菌落划线营养琼脂平板，更好地分离单个菌落。

37℃±1℃下培养24h±3h。

使用纯培养物做生化鉴定和血清学鉴定。

9.5.3生化鉴定9.5.3.1概述用接种针将9.5.2获得的菌落接种至9.5.3.2到9.5.3.7培养基中。

9.5.3.2TSI 琼脂在斜面琼脂上划线并穿刺。

37℃±1℃下培养24h±3h。

按照下面说明记录培养基的变化：a）底层黄色：葡萄糖阳性（葡萄糖利用）红色或无变化：葡萄糖阴性（葡萄糖不理用）泡沫或葡萄糖产气形成龟裂b）斜面黄色：乳糖和/或蔗糖阳性（乳糖和/或蔗糖利用）红色或无变化：乳糖和/或蔗糖阴性（乳糖和/或蔗糖不利用）典型沙门氏菌为碱性（红色）斜面和酸性（黄色）底部，产气（泡沫），并且（90％个例）产生硫化氢（琼脂变黑）（9.5.3.8）。