实验四 淀粉酶的初步分离纯化

α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。

20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。

到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。

但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。

20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。

自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。

20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。

而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。

同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。

气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。

20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。

工业淀粉酶的纯化与分析一．实验目的1．掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法2．掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术3．掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法4．学习Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法二．实验原理工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。

利用葡糖糖凝胶G-25对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。

酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化学反应的初速度来表示的。

在本实验中，是以一定量的淀粉酶在37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成1mg还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用DNS法测定。

蛋白质在Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在500nm波长下的吸光度，从而求得样品中蛋白质的含量。

三．实验材料及仪器设备1．材料：工业淀粉酶2．仪器：电子天平；离心机；UV9100型分光光度计恒温水域；沸水浴3．器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1;研钵：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；层析装置：1套；量筒：100ml*1；洗耳球：2个；胶头滴管：2个；移液管架；玻璃棒四．实验试剂BaCl2 溶液（1%）考马斯亮蓝G-2501%NaCl溶液淀粉溶液（0.5%）磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH 6.8） NaOH溶液（2.5mol/L）牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml）Folin-酚试剂甲 Folin-酚试剂乙葡萄糖标准液（1mg/ml） DNS试剂五．实验步骤1.浸提称取0.317g淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液1.2ml于离心管中，标记为“粗酶液”备用。

记录剩余体积为18.2ml并转移到50ml烧杯里，置于冰浴中。

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。

3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。

二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。

3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

1. 学习粗酶的提取和纯化方法。

2. 掌握蛋白质沉淀、离心、透析等纯化技术。

3. 观察和分析酶的纯化效果。

二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一、可逆等特性。

粗酶的提取和纯化是研究酶性质和功能的重要步骤。

本实验以淀粉酶为例，通过酶的提取、沉淀、离心、透析等步骤，实现对酶的初步纯化。

三、实验材料与仪器材料：1. 淀粉酶粗酶液2. 95%乙醇3. 氯化钠溶液4. 透析袋5. 离心机6. 移液器7. 容量瓶8. pH计9. 烧杯仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 恒温水浴锅4. 酶标仪1. 酶的提取- 称取适量淀粉酶粗酶液，加入适量的95%乙醇，搅拌均匀，室温静置30分钟。

- 取上清液，用pH计调整pH至7.0，备用。

2. 酶的沉淀- 将调整pH后的酶液加入适量的氯化钠溶液，搅拌混合，室温静置30分钟。

- 取上清液，用离心机离心10分钟（3000 r/min），取沉淀。

3. 酶的透析- 将沉淀溶解于适量的去离子水中，用透析袋透析过夜，去除小分子杂质。

4. 酶的活性测定- 取适量透析后的酶液，用酶标仪测定酶活性。

五、实验结果与分析1. 酶的提取- 实验结果显示，淀粉酶粗酶液在95%乙醇和氯化钠溶液的作用下，酶的活性有所降低，但仍有部分酶活性保留。

2. 酶的沉淀- 通过离心和沉淀，大部分酶蛋白被沉淀下来，上清液中酶活性明显降低。

3. 酶的透析- 透析过程中，酶分子逐渐通过透析袋，去除小分子杂质，酶的活性得到进一步提高。

4. 酶的活性测定- 通过酶标仪测定，透析后的酶活性比粗酶液提高了约3倍。

六、实验结论本实验通过酶的提取、沉淀、离心、透析等步骤，实现了对淀粉酶的初步纯化。

实验结果表明，通过适当的纯化方法，可以有效提高酶的活性，为后续的酶学研究提供基础。

七、实验注意事项1. 实验过程中，应注意无菌操作，避免酶液污染。

2. 操作过程中，应避免剧烈搅拌，以免破坏酶的活性。

3. 透析过程中，应选择合适的透析袋，确保酶分子顺利通过。

α-淀粉酶的提‎取、分离及测定‎（生化试验小‎组-2005.4）试验全程安‎排：试验一、色谱分离淀‎粉酶1.1 试剂及设备‎离子交换树‎脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试‎管）1.5ml离心‎管紫外分光光‎度计α-淀粉酶样品‎秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液‎（pH8.0，0.01M磷酸‎盐缓冲液）洗脱缓冲液‎（平衡缓冲液‎+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化‎钠）试剂瓶1.2 离子交换色‎谱原理与方‎法色谱(chrom‎a togr‎a phy)是一种分离‎的技术,随着现代化‎学技术的发‎展应运而生‎。

20世纪初‎在俄国的波‎兰植物化学‎家茨维特(Twsee‎t)首先将植物‎提取物放入‎装有碳酸钙‎的玻璃管中‎，植物提取液‎由于在碳酸‎钙中的流速‎不同分布不‎同因此在玻‎璃管中呈现‎出不同的颜‎色，这样就可以‎对各种不同‎的植物提取‎液进行有效‎的成分分离‎。

到1907‎年茨维特的‎论文用俄文‎公开发表，他把这种方‎法命名为c‎hroma‎t ogra‎p hy, 即中文的色‎谱，这就是现代‎色谱这一名‎词的来源。

但由于茨维‎特当时没有‎知名度，而且能看懂‎俄文的人也‎不多，加之很快爆‎发了第一次‎世界大战，茨维特的分‎离方法一直‎被束之高阁‎。

20世纪2‎0年代，许多植物化‎学家开始采‎用色谱方法‎对植物提取‎物进行分离‎，色谱方法才‎被广泛地应‎用。

自20世纪‎40年代以‎来以Mar‎t in 为首‎的化学家建‎立了一整套‎色谱的基础‎理论使色谱‎分析方法从‎传统的经验‎方法总结归‎纳为一种理‎论方法，马丁等人还‎建立了气相‎色谱仪器使‎色谱技术从‎分离方法转‎化为分析方‎法。

20世纪5‎0年代以后‎由于战后重‎建和经济发‎展的需要，化学工业特‎别是石油化‎工得到广泛‎的发展，亟需建立快‎速方便有效‎的石化成分‎分析。

而石化成分‎十分复杂，结构十分相‎似，且多数成分‎熔点又比较‎低，气相色谱正‎好吻合石化‎成分分析的‎要求，效果十分明‎显、有效。

自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。

淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。

根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。

α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。

如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。

随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。

70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。

研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。

除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。

Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。

土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究土壤是微生物的自然栖息地，其中存在着大量的微生物群体。

其中，淀粉酶微生物是土壤中的一种重要群体。

淀粉酶微生物可以利用土壤中的淀粉为能源，将淀粉水解成葡萄糖等单糖，为土壤中的其他微生物提供了能量。

此外，淀粉酶微生物还能够分解淀粉质的残留物，促进土壤的有机质分解，有助于土壤肥力的提高。

因此，分离纯化土壤中的淀粉酶微生物对于了解土壤微生物群体的结构和功能，以及发掘土壤微生物资源具有重要意义。

本文将从土壤中分离淀粉酶微生物的方法、淀粉酶微生物的特性以及淀粉酶微生物的应用等方面进行探讨。

一、土壤中分离淀粉酶微生物的方法土壤中淀粉酶微生物的分离是一个相对复杂的过程。

一般来说，可以采用筛选法、培养法、分子生物学技术等方法。

筛选法是一种最常用的土壤淀粉酶微生物分离方法。

其原理是利用淀粉为唯一碳源，在含有淀粉的培养基上筛选出淀粉酶微生物。

具体操作步骤为：将土壤样品通过筛网筛选后，制备不同浓度的稀释液，分别接种到含有淀粉的培养基上，进行培养。

待出现淀粉水解圈后，将圈内菌落进行分离、筛选，最终获得淀粉酶微生物。

培养法是通过将土壤样品接种到含有淀粉的液体或固体培养基中，利用淀粉为唯一碳源，诱导淀粉酶微生物生长和繁殖。

培养法的优点是可以获得纯种菌株，但是其缺点是存在一定的选择性，不能完全反映土壤微生物群体的整体结构。

分子生物学技术是一种新型的土壤微生物分离方法。

其原理是通过对土壤样品中微生物的DNA序列进行分析，筛选出含有淀粉酶基因的微生物。

该方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，但其操作难度较大，需要专业技术支持。

二、淀粉酶微生物的特性淀粉酶微生物是一类能够分解淀粉的微生物群体。

淀粉酶微生物广泛存在于土壤中，并具有以下特性：1.多样性。

淀粉酶微生物包括细菌、真菌、放线菌等多种微生物群体，具有较高的多样性。

2.分解效率高。

淀粉酶微生物能够高效地将淀粉水解为葡萄糖等单糖，其分解效率高于一般的微生物群体。

实验四淀粉酶的初步分离纯化一、目的和要求1.掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；2.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。

3.掌握膜分离原理和方法二、基本原理1.蛋白质的盐析蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷）维持胶体的稳定性。

由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类[如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等]时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。

由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。

盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。

2.透析脱盐的原理蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1～100nm）内，不能透过半透膜。

选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。

把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。

这种方法可除去和蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质，是常用来纯化蛋白质的方法。

透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。