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抗菌药品能够用于治疗各种细菌感染以及致病微生物的感染，抗生素在人类的生活中产生了重要的作用。
但长期使用抗生素也会导致细菌产生耐药性。
当前防治水生生物遭受细菌感染的主要手段还是依赖于抗菌药物，科学合理的使用抗菌药物，能够有效的治疗水生生物的细菌感染，但是一旦滥用药物，就会造成水产养殖中产生的细菌形成耐药性，从而加大生产养殖的成本，对养殖水域造成污染，引发水产残留药品超标。
一、细菌耐药性的介绍细菌耐药性指抗菌药物无法对细菌产生效果，细菌对抗菌药物不敏感，是细菌在生存中产生的一种特殊的表现形式，细菌耐药性主要分为获得耐药性以及固有耐药性获得耐药性主要指细菌在与抗菌药物进行接触之后，通过质粒介导，改变自身的代谢方式，产生抵抗抗菌药物的能力，获得耐药性能够通过质粒将耐药基因传递给后代，成为固有耐药性，在长时间不接触抗菌药物时也会逐渐消失。
固有耐药性又称称之为天然耐药性，形成原因是细菌的结构与化学组成上的不同导致细菌本身对抗菌药物不敏感，天然耐药性是由细菌的染色体基因决定的。
世代相传，不会造成改变。
二、水产养殖细菌耐药产生原因分析鱼类致病菌产生耐药性的关键原因在于没有按照规范使用相关的抗菌药物。
在以下几个方面得以体现：1、没有明确抗菌药物的抗菌谱使用一种或是同一类的抗菌药物时，首先要诊断感染病的类型，对病原体感染部位都要有充分的了解，也要对当前使用的抗菌药物所对应的抗菌谱有着充分的了解。
在使用抗菌药物时，要充分的对照抗菌谱，抗菌谱泛指一个种类的抗菌素所能消除或抑制的细菌种类，对于一种或是一类的抗菌药物来说，药物的作用机制决定了这种药物的抗菌谱，在使用抗菌药物时，要遵循以下的原则：对于能够使用窄谱抗菌药物解决的感染病，就要避免使用广谱抗生素;能够使用一种抗菌药物解决的感染病，就不要将多种抗菌药物进行混合的使用。
2、未通过系统化的抗敏实验就使用抗菌药物药物的敏感实验主要是指测定病原微生物对于有一种或某一类的抗菌药物的敏感度，通过临床的指导来科学合理的选择抗菌药物的使用以及实验，在使用抗菌药物之前，科学准确的进行药敏试验，能够选取合适的抗菌药物投入使用，进行药敏试验不仅能够减少抗生素的使用时间，也能减少病原体的抗药性，同时提升药物治疗效果。
羔羊腹泻病原菌常规分离鉴定及药敏试验汤继顺;惠文巧;朱德建;陈胜;苏世广【摘要】从安微省合肥、滁州地区的肉羊养殖场中共采集到羔羊腹泻粪样11份，进行细菌分离培养与镜检，将分离的细菌进行纯培养，并进行生化鉴定、药敏试验和小鼠攻毒致病性检验。
结果显示：在检测的11份粪样中，共检测出大肠杆菌11株、奇异变形杆菌7株；致病性试验显示大肠杆菌和奇异变形杆菌均对小鼠有致病力，但奇异变形杆菌致病性弱于大肠杆菌；药敏试验显示分离菌株对恩诺沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、菌必治、复方新诺明、丙氟哌酸、头孢唑啉等敏感，对庆大霉素、氟哌酸等常规药物均表现出一定的耐药性，对青霉素、链霉素、克拉霉素、红霉素和强力霉素等完全耐药。
结果表明，大肠杆菌和奇异变形杆菌都有一定的致病性，上述地区羔羊腹泻是由混合感染引起，且混合感染致病性更强。
%In order to isolate and identify the pathogens using conventional methods as well as select the useful drug treatment for lamb diarrhea,the 11 fecal samples from lambs with diarrhea were collected from the mutton sheep/goat farms in Hefei and Chuzhou city. 11 samples ofE.coliand 7 samples ofProteusmirabilisin the 11 fecal samples were detected,then the separated bacteria was purely cultured,biochemically identified,the drug sensitive test and the toxic pathogenic experiments in mice were carried out. The pathogenicity test showed thatE.coliandProteusmirabiliswere virulent to mice,but the pathogenicity ofProteus mirabiliswas weaker than that of theE.coli. The drug sensitivity test showed thatenrofloxacin,florfenicol,kanamycin,amikacin,ceftriaxone,cotrimoxazole,norfloxacin propionate and cefazolin wereeffective to the seperated bacteria;gentamicin and nor-floxacin a little effective,penicillin,streptomycin,clarithromycin and doxycycline ineffective. It is concluded thatE.coliand Proteusmirabilishave certain pathogenicity,lamb diarrhea in these regions is caused by the mixed infection,and which is more pathogenic.【期刊名称】《中国草食动物科学》【年(卷),期】2016(036)004【总页数】4页(P42-45)【关键词】羔羊腹泻;大肠杆菌;奇异变形杆菌;分离鉴定;药敏试验【作者】汤继顺;惠文巧;朱德建;陈胜;苏世广【作者单位】安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031【正文语种】中文【中图分类】S858.26在动物临床诊断技术日益发展的今天，越来越多的先进实验诊断方法不断涌现，为疾病确诊提供了更多的选择，但常规的实验操作和诊断方法不需要较高的实验操作技能和昂贵的设备，仍存在一定应用价值，可供临床诊断选择。
水产动物病原药物敏感性实验技术作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2017年第21期随着水产养殖业的迅猛发展，高密度、集约化养殖虽然带来了水产品产量的不断攀升，但是同时也使得水产养殖动物的生存环境日渐恶化，从而导致各类疾病频发。
病害发生导致重大经济损失的原因常常是没有做到准确诊断，没有做到对病用药，通常是凭经验进行诊断用药。
因此有必要提高水产一线从业者进行病原分离，开展药物敏感性实验的意识，以做到准确诊断鱼病，对病用药。
本文将就药物敏感性实验进行介绍及改良，从而更好地供同行参考及应用好药物敏感性实验。
1?药物敏感性实验使用范围药物敏感性实验（简称药敏实验，）涉及到病原及药物两方面，因此病原必须是可体外培养的，可分离的，而药物目前常用抗生素都有市售药敏纸片供选择，而针对其他药物如消毒剂等，则可进行相应的MIC/MBC测定，从而评估病原对其敏感性。
目前可以进行药敏实验的病原只有细菌、真菌以及一些寄生虫（寄生虫的药敏实验主要以活虫体在药物刺激下挣扎程度来反应的）。
2?药物敏感性实验操作目前药敏实验主要分为琼脂扩散法（即K-B法）及倍比稀释法，而琼脂扩散法又分为打孔法及药敏纸片法。
一般以药敏纸片法及倍比稀释法最常用。
无菌条件下，取患濒死水产养殖动物，取病灶及重要组织器官如肝肾脾等，用接种环蘸取所取各样品在固体培养基上划线，置于28℃恒温培养箱中培养24h。
从已经长好菌落的平板上挑取形态大小、颜色相近的菌落进一步纯化培养。
向分离得到的纯化菌株加入25%甘油，混匀后于-80℃冷冻保存。
药敏纸片法：将分离株接种于液体培养基中，经200r/min恒温28℃震荡培养18h，用无菌生理盐水调整分离株浓度为104-108CFU/mL，取100μL菌液均匀涂布于固体琼脂培养基上，贴上不同种类的药敏纸片，28℃恒温培养24h后测量抑菌直径，根据药敏纸片说明书或者其他标准判定分离株对不同药物的敏感性。
倍比稀释法：主要是通过使用液体培养基倍比稀释药物，然后在每个浓度药物内接种病原，恒温培养24h后，把无菌生长、稀释度最大的药物如消毒剂浓度作为分离株的MIC，取所有无菌生长的组涂布于固体培养基上，恒温培养24h后观察有无菌落生长，平板上无菌落生长的最低药物如消毒剂浓度即为MBC。
几种常见淡水鱼致病菌的药敏试验摘要研究了强力霉素、盐酸左氧氟沙星、诺氟沙星、红霉素、甲硝唑、土霉素、氟苯尼考、氟强先锋、呋喃妥因9种抗生素和五倍子、大黄、金银花、黄芩、陈皮、黄连、板蓝根、黄柏、连翘、黄梅10种中草药对迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌和藤黄微球菌5种常见淡水鱼类致病菌的体外抑菌效果。
结果显示：抗生素中氟苯尼考、诺氟沙星、红霉素、呋喃妥因对这几种致病菌抑菌效果明显；中草药中五倍子、大黄、黄芩的抑菌效果较好。
关键词淡水鱼致病菌；中草药；抗生素；药敏试验近年来，随着水产养殖规模的扩大和集约化程度的提高，养殖环境日益恶化，近年来水产养殖病害发病率越来越高。
细菌性疾病是水产养殖动物最重要的疾病之一，2005年以来暴发的生物源性疾病中，细菌性疾病所占比例超过55%，严重制约了水产业的发展[1]。
由于渔民缺乏基本的药理知识，存在滥用抗生素类药物的现象，导致耐药菌株的产生，给细菌病的防治带来了很大的困难。
选取了迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌和藤黄微球菌5种常见淡水鱼的致病菌进行体外中西药抑菌试验，旨在为淡水鱼细菌病防治提供依据，减少致病菌耐药菌株的产生。
金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌和藤黄微球菌，均是淡水养殖动物最常见的致病菌，它们的大量繁殖给淡水鱼类养殖业带来巨大威胁。
其中金黄色葡萄球菌是毒力最强的引起化脓性疾病的化脓菌，可以产生溶血毒素、肠毒素、血浆凝固酶等毒素和酶，引起水生动物外伤化脓死亡[2]。
嗜水气单胞菌通常能够引起的疾病多为暴发性传染病，患病水生动物死亡率较高，通常导致鱼、鳖、鳗、牛蛙及蚌等水生动物的败血症及局部感染[3]。
藤黄微球菌是黄鳝出血病的主要病原，黄鳝感染后出现体表弥散性出血、肛门红肿外翻、肝脏肿大出血等症状并造成高死亡率[4]。
嗜麦芽寡养单胞菌是近年来引起斑点叉尾鮰高致死性、传染性疾病的主要病原之一，发病鱼主要出现体表褪色斑、脱肛、严重肠炎和腹水等病征，并以肠套叠为主要病理特征，其发病率和死亡率均在90%以上，造成的经济损失极其严重[5]。
2019.102018年笔者对泗阳县运河北片草鱼养殖进行了疫病监测与流行病学调查，并对具有典型症状的发病草鱼进行了病原菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗菌药物敏感性试验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据。
一、材料与方法1.试验材料(1)2018年4－10月在草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型发病症状草鱼进行分离，分离部位为血液，采样时间、地点、症状、API－20E 生化反应编号、菌株种类详细情况见表1。
(2)营养肉汤、营养琼脂、TCBS 琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京陆桥。
肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(英文名API 20E)购于梅里埃诊断产品(上海嘉合)有限公司。
动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。
2.试验方法细菌分离鉴定和菌株对药物感受性试验在县水产站病害检测无菌操作室内进行。
试验操作遵循《鱼类细菌病检疫技术规程(SC/T 7201.1－2006、SC/T 7201.1－2006)》和梅里埃API－20E 试剂条鉴定及南京菲恩动物用药敏分析试剂板操作流程。
二、试验结果1.嗜水气单胞菌分离及形态特征观察从病鱼血液分离到的嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，28℃培养18～24小时，形成圆形光滑、边缘整齐、湿润、微凸、微白色菌落，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、湿润，周围出现清晰的溶蛋白透明圈，革兰氏染色阴性，油镜视野下短杆状。
2.嗜水气单胞菌的氧化酶试验和生理生化鉴定对分离的细菌进行生理生化检测，结果判定为嗜水气单胞菌的具体生理生化特征见表2。
依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》(1994)“气单胞菌属细表1菌株分离清单汇总442019.10表312株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)对照毫克/升菌种间特征鉴别表”对分离到的嗜水气单胞菌进行Ⅰ和Ⅱ分类，并分别命名为Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅱ－1、Ⅱ－2、Ⅱ－3、Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－6、Ⅱ－7、Ⅱ－8、Ⅱ－9。
与耐药机制有关药敏试验的规范化与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。
前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。
耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。
因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。
在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。
但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。
真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。
我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。
本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。
也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。
包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。
第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。
首先介绍青霉素酶的检测。
检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。
其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的β- 内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。
头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生β- 内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。
方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。
质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。
注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行β- 内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
鳜鱼池塘精养与虾鳜共作两种养殖模式技术要点赵来兵1蒋阳阳2*崔凯2吴明林2李海洋2周蓓蓓2（1东至县农业综合行政执法中队，安徽池州247299；2安徽省农业科学院水产研究所/水产增养殖安徽省重点实验室，安徽合肥230031）摘要鳜鱼是在长三角地区养殖的高档水产品，对水质要求较高，相比其他养殖鱼类对溶氧要求更高，鱼塘水质应常年保持“肥、活、嫩、爽”的标准。
本文总结了池州地区池塘精养及虾鳜共作两种鳜鱼养殖模式技术要点，包括放养前准备、苗种放养规格及密度、日常管理措施、病害防控等，并针对性提出两种养殖模式下水质调控建议，以期为安徽地区广大鳜鱼养殖户提供技术参考。
关键词鳜鱼；池塘精养；虾鳜轮作；技术要点中图分类号F963.7文献标识码A文章编号1007-5739（2023）17-0179-03DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.17.046开放科学（资源服务）标识码（OSID）：鳜鱼（Siniperca chuatsi）属于鲈形目、鮨科、鳜亚科、鳜属，俗称“桂花鱼”“季花鱼”“鳌花鱼”，是我国传统的名贵淡水鱼类，享有“淡水石斑鱼”美誉[1]。
其肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺、营养价值高，蛋白质含量为19%，必需氨基酸含量高达6.3%，呈鲜味氨基酸含量也高达5.4%[2]，深受消费者喜爱。
2021年我国鳜鱼养殖产量已增至37.7万t[3]，产值逾200亿元[4]，是最具发展潜力的养殖品种之一。
安徽省2021年鳜鱼养殖产量4.4万t[3]，较上一年度增长了4.9%，位居全国第3位，占全国鳜鱼产量的12.3%，养殖产业呈现出较好发展势头。
池州市位于长江下游南岸，境内水资源丰富，通江河流湖泊众多，自古盛产鳜鱼。
相传在梁五代时期，昭明太子萧统食秋浦河鳜鱼后盛赞秋浦河水好鱼美，封秋浦河为“贵池”；宋代诗人杨万里用“一双白锦跳银刀，玉质黑章大如掌”的诗句，将秋浦花鳜描绘得栩栩如生，可见池州鳜鱼历史悠久、文化底蕴深厚。
DB34安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范Standard for Drug sensitivity test and drug resistance test of pathogenicbacteria from cultured fishes in Anhui Province(征求意见稿)2018-××-××发布2018-××-××实施前言本标准规范按照GB/T1.1-2009编写。
本标准由安徽农业大学动物科技学院提出。
本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、安徽省水产技术推广总站、安徽海辉水产养殖有限公司本标准主要起草人：彭开松，吴敏，唐庆权，樊慧敏，许晓牧，魏泽能，蒋军，朱若琳，姜守松，王黎明，贾俊威，檀基良，曹学志安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范1 范围本标准适用于安徽省境内增养殖淡水鱼类病原细菌的药敏试验和耐药性检测。
主要包括以下技术内容：（1）样品采集；（2）病菌的分离和鉴定；（3）抑菌圈直径测定；（4）最小抑菌浓度测定；（5）耐药性检测。
本标准适用于水生动物疾病的诊疗、教学、科研、服务单位及有关管理部门从事相关工作参考。
2 规范性引用文件下列文件中的条款，通过本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分。
鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GBT 27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验WS/T 125-1999 中华人民共和国卫生行业标准纸片法抗菌药物敏感试验标准中华人民共和国兽药典（一部）中华人民共和国兽药典兽药使用指南（化学药品卷）EUCAST 欧盟药敏试验标准（李玉庆等编译，中国标准出版社，2016年3月）GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定3 定义下述定义适用于本标准3.1 活鱼：具有典型症状和大体病变的活鱼或濒死鱼。
3.2 冻鱼：活鱼断头处死后装入新塑料自封袋，在-20℃冻存6～12小时的鱼。
3.3 冰鱼：活鱼断头处死后装入新干净塑料自封袋，在湿冰中存放6～12小时的鱼。
3.4 死鱼: 死后在养殖水体中留存6～12h的鱼。
3.5 病菌：从患鱼病变组织、脏器（如肾脏、脾脏、肝胰腺）或血液中分离的鱼类致病菌，人工感染本动物可复制出自然病例所表现的部分或全部症状和病变。
3.6 系统感染性疾病：病菌突破消化道、鳃、皮肤等屏障，经血液循环引起全身感染，表现出败血症、脏器变性坏死或炎症等，可从血液和脏器中分离到该病菌。
3.7 抗菌药物：本标准中所指抗菌药物是我国药典或农业部规范性文件中允许使用的具有抗菌活性的内服药物，不包括生物制品、中草药和消毒剂等。
3.8 纸片扩散法: 也称为K-B法，将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的固体培养基表面上，培养后测定纸片周围透明抑菌圈直径，定性判断测试菌对该药物的敏感性。
3.9 微量肉汤稀释法：通过在微量培养板中测定倍比稀释的抗菌药物对测试菌的生长抑制情况，定量测定药物对细菌的最小抑菌浓度。
3.10 最小抑菌浓度（MIC）：肉汤稀释法中测定抗菌药物抑制某一种细菌可见生长的最低浓度。
3.11 最小杀菌浓度(MBC)：指杀死99.9%（使得细菌密度降低3个数量级）的供试细菌所需的最低药物浓度。
4 材料样品采集需要解剖器械（剪刀和镊子等）、无菌棉试子、塑料自封袋、保温采样箱、乳胶手套、网具等。
纸片法所需材料同WS/T 125-1999。
微量肉汤稀释法所需材料同EUCAST 欧盟药敏试验标准。
5 样品采集5.1 样品质量分离病菌的样品质量依次为：活鱼＞冰鱼＞冻鱼＞死鱼。
无法获得前三种样品时，才考虑死鱼。
样品数量多或动物个体大，用无菌棉试子充分吸收样品中的体液或直接蘸取小块组织，保存于采样管。
将棉试子、组织或整条鱼等样品在4℃保温箱或冰盒中运送。
5.2 样品数量典型症状和大体病变的患鱼或濒死鱼3～5尾作为分离病菌样品。
行为正常和外观健康的3～5尾鱼作为对照。
如果症状和大体病变复杂，可以适当增加样品数量。
6 病菌的分离和鉴定送检样品到达实验室后应立即处理，不能过夜存放。
以下均要求无菌操作。
6.1 培养基根据临床资料所提示的疑似病菌的特性，选择和制备培养基（见附录一和附录二）。
6.2 病菌分离方法根据样品大小和感染类型，选择以下某种接种方法。
样品接种平板后，采用划线法，分离病菌。
（1）腹腔肝脾肾接种法：适合体长大于5cm的鱼。
75%酒精体表消毒后，剪除腹壁，暴露腹腔脏器。
摘下肝胰腺或脾脏，剪一断面接种平板；或者在体肾（或肝胰腺）中部剪开供接种环插入的切口，蘸取样品接种平板。
（2）背部体肾接种法：适合体长3～5cm的鱼。
75%酒精体表消毒后，剪除背鳍。
从背鳍后基部纵向剪开肌肉，并暴露体肾，用接种环或棉签沾取样品接种平板。
（3）体表损伤组织接种法：选新鲜病灶，在损伤与健康组织的交界处,无菌采集约1μL的样品，接种平板。
6.3病菌的鉴定利用形态学、生理生化特性和16SrDNA测序等鉴定分离菌。
6.4 致病性鉴定经毒力基因检测和本动物回归攻毒试验，确定分离菌的致病性。
7抑菌圈直径测定根据细菌鉴定结果，选择进行纸片法药敏试验的培养基（附录四）。
在水平的超净台上倾倒平板。
固体培养基厚度为4 mm ± 0.5 mm。
培养基凝固后，在37℃温箱中除去明水，放在超净台中备用。
如制备好的培养基可用塑料自封袋密封后，在4～8℃存放7～14天，用前在37℃温箱中除去明水。
灭菌生理盐水稀释过夜培养的待测菌，使菌液浓度为0.5麦氏浊度（或108cfu/mL）。
制备的菌悬液在15～60 min内使用完。
灭菌棉试子蘸取菌悬液，在管壁内侧挤去多余水，将菌均匀涂布在琼脂表面。
15min之内，将药敏纸片（药敏纸片含药标准见附录三）均匀平坦紧贴到平板上。
内径9cm和15cm的平板，最多可分别均匀放置6个和12个药敏纸片，纸片中心之间距离至少2cm。
药敏纸片贴好后，倒置平板并在15min内将培养皿（最高叠放5层）放到相应温度的培养箱（附录四）中培养16～20h。
取出培养皿，放在眼前30cm处，测量抑菌圈直径（单位mm）。
根据附录六所列的折点值，判断敏感性。
对结果判定为敏感的菌株，孵育时间满24h后，再测一次抑菌圈直径。
如果在培养皿表面仅见单菌落，说明接种量不够，要重新进行试验。
8 最小抑菌浓度测定最小抑菌浓度测定采用微量肉汤稀释法。
根据细菌鉴定结果，选择进行纸片法药敏试验的培养基（附录五）。
抗菌药物批号、效价、有效期和存储条件，必须明确，并按要求存放在4～8℃的干燥器内。
抗菌药物储存液：使用储存液配制溶剂（附录三）溶解抗菌药物，且使储存液中抗菌药物的浓度高于1 g/L。
配制储存液的溶剂根据需要采用过滤除菌或高压蒸汽灭菌。
抗菌药物工作液：抗菌药物工作液的浓度必须覆盖菌株的所有MIC终点。
使用配制抗菌药物工作液的溶剂（附录三）稀释储存液制备工作液，其最高浓度应为MIC上限值的4倍，然后采用倍比稀释法稀释。
工作液一般在一天内使用完毕。
在微量培养板中加入倍比稀释后的工作液，每孔加100μl，做2个重复。
用生理盐水调整过夜培养的新肉汤培养物使其浓度为0.5麦氏浊度（浓度约为108cfu/毫升）。
再用肉汤稀释1000倍，使接种菌工作液浓度为5×105cfu/毫升。
接种菌悬液最好在30min内用完，否则应存放在冰上。
在测试孔和阳性对照孔中，每孔加待测菌工作液100μL。
阴性对照孔，只加不含药物的肉汤100μL，作为评判无菌操作质控的阴性对照。
微量培养板布好后加盖，使用塑料自封袋密封后，放入培养箱中孵育。
微孔板的叠层不超过5层。
培养16～20h，当阳性对照孔变浑浊，而阴性对照孔仍然清亮，才能读取试验结果。
将测试孔与阴性孔和阳性孔，进行比对，读取最小抑菌浓度。
8 耐药性检测8.1纸片法抑菌圈直径小于耐药性折点直径，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。
8.2最小抑菌浓度法最小抑菌浓度大于耐药性折点浓度，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。
8.3 MBC/MIC比值法最小抑菌浓度（MIC）结果读取结束后，取药物浓度高于MIC值的各孔中的培养物进行细菌计数。
同时，取阳性对照孔菌液进行计数。
细菌计数方法同GB4789.2-2016。
当阳性对照孔细菌浓度/清亮孔细菌浓度=1000时，该清亮孔所对应的药物浓度就是最小杀菌浓度（MBC）。
MBC孔一般是在MIC孔之前。
当MBC/MIC≥32时，可判定该菌对某种药物有耐药性。
资料性附录附录一：试剂和培养基1.生理盐水8.5克氯化钠加入1升水，121℃15分钟高压蒸汽灭菌，备用。
2.牛心脑浸出液琼脂（BHIA）胰蛋白胨20克，氯化钠10克，牛心浸粉10克，葡萄糖4克，磷酸氢二钠5克，琼脂15克，1升水，pH7.4, 121℃15分钟高压蒸汽灭菌，倾倒平板。
3.水解酪蛋白（Meller-Hinton）肉汤(MHB)牛肉粉1克，可溶性淀粉1.5克，酸水解酪蛋白17.5克，琼脂15克，1升水，pH7.4, 121℃15分钟高压蒸汽灭菌。
在MHB基础上添加1.5%琼脂为MHA。
4.TYEA胰蛋白胨1.4克，酵母膏0.4克，MgSO4•7H2O 0.5克，CaCl2•H2O 0.5克，琼脂10克，pH 7.2，121℃、15分钟高压蒸汽灭菌。
5.Cytophaga 琼脂胰蛋白胨0.5克，酵母膏0.5克，醋酸钠0.5克，牛肉膏0.2克，琼脂10克，1升水，pH 7.2 ~ 7.4，121℃、15分钟高压蒸汽灭菌。
6.Middle-brook-ADH-enrichment-added Middle brook 7H11硫酸铵0.5g、磷酸二氢钾1.6g、磷酸氢二钠1.4g、柠檬酸钠0.4g、硫酸镁0.05g、胰酪蛋白胨1.0g、硫酸锌0.001g、硫酸铜0.001g、L-谷氨酸钠0.5g、柠檬酸铁铵0.04g、盐酸吡哆醇0.001g、生物素0.5mg、孔雀石绿0.25mg。
取本品5.5克，加5毫升甘油，加900毫升蒸馏水，121℃高压灭菌10分钟。
冷却50-55℃时，加入过滤除菌的OADC添加剂100毫升，混匀；然后按说明书添加ADH(精氨酸双水解酶氯化钠肉汤),混匀备用。
如果在高压蒸汽灭菌前，加入13.5克琼脂，后面操作相同，制备得对应固体培养基。
OADC添加剂：，牛白蛋白（V组分）5克、油酸0.06 毫升、葡萄糖2克、触酶0.003克、氯化钠0.85克、蒸馏水100 毫升，过滤除菌。
