离子交换柱层析原理

离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。

现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。

离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。

离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。

1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。

离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。

几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。

由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。

目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。

2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。

离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。

电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。

平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。

平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。

在一定条件下,溶液中得某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就就是离子交换层析得基本置换反应。

通过在不同条件下得多次置换反应,就可以对溶液中不同得离子基团进行分离。

下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析得基本分离过程。

阴离子交换剂得电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中得带负电得平衡离子结合。

待分离溶液中可能有正电基团、负电基团与中性基团。

加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆得置换反应,而结合到离子交换剂上、而正电基团与中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。

通过选择合适得洗脱方式与洗脱液,如增加离子强度得梯度洗脱、随着洗脱液离子强度得增加,洗脱液中得离子可以逐步与结合在离子交换剂上得各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。

与离子交换剂结合力小得负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强得需要较高得离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大得顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目得。

各种离子与离子交换剂上得电荷基团得结合就是由静电力产生得,就是一个可逆得过程、结合得强度与很多因素有关,包括离子交换剂得性质、离子本身得性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。

离子交换层析就就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力得差异,并通过改变离子强度、pH 等条件改变各种离子与离子交换剂得结合力而达到分离得目得、离子交换剂得电荷基团对不同得离子有不同得结合力、一般来讲,离子价数越高,结合力越大;价数相同时,原子序数越高,结合力越大。

如阳离子交换剂对离子得结合力顺序为:Lｉ+<Ｎa+〈K+＜Rb+＜Cs＋;Na＋〈Ca2+＜Ａl3＋<Ti4+蛋白质等生物大分子通常呈两性,它们与离子交换剂得结合与它们得性质及ｐH 有较大关系。

以用阳离子交换剂分离蛋白质为例,在一定得ｐＨ条件下,等电点pＩ〈pH 得蛋白带负电,不能与阳离子交换剂结合;等电点pI 〉pＨ得蛋白带正电,能与阳离子交换剂结合,一般pＩ越大得蛋白与离子交换剂结合力越强。

但由于生物样品得复杂性以及其它因素影响,一般生物大分子与离子交换剂得结合情况较难估计,往往要通过实验进行摸索、3.离子交换层析介质得种类与性质:3.１离子交换剂得基质:离子交换剂得大分子聚合物基质可以由多种材料制成,苯乙烯系离子交换剂就是以苯乙烯与二乙烯苯合成得具有多孔网状结构得聚苯乙烯为基质。

苯乙烯系离子交换剂机械强度大、流速快。

但它与水得亲与力较小,具有较强得疏水性,容易引起蛋白得变性、故一般常用于分离小分子物质,如无机离子、氨基酸、核苷酸等。

以纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质得离子交换剂都与水有较强得亲与力,适合于分离蛋白质等大分子物质、3、2离子交换剂得电荷基团:根据与基质共价结合得电荷基团得性质,可以将离子交换剂分为阳离子交换剂与阴离子交换剂。

阳离子交换剂得电荷基团带负电,可以交换阳离子物质。

根据电荷基团得解离度不同,又可以分为强酸型、中等酸型与弱酸型三类。

它们得区别在于它们电荷基团完全解离得pH 范围,强酸型离子交换剂在较大得pH 范围内电荷基团完全解离,而弱酸型完全解离得pH 范围则较小,如羧甲基在pH小于６时就失去了交换能力、一般结合磺酸基团,如磺酸甲基、磺酸乙基等为强酸型离子交换剂,结合磷酸基团与亚磷酸基团为中等酸型离子交换剂,结合酚羟基或羧基,如羧甲基为弱酸型离子交换剂。

一般来讲强酸型离子交换剂对H 离子得结合力比Na+离子小,弱酸型离子交换剂对Ｈ离子得结合力比Na＋离子大。

阴离子交换剂得电荷基团带正电,可以交换阴离子物质。

同样根据电荷基团得解离度不同,可以分为强碱型、中等碱型与弱碱型三类、一般结合季胺基团,如季胺乙基为强碱型离子交换剂,结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或弱碱型离子交换剂,如结合二乙基氨基乙基为弱碱型离子交换剂。

一般来讲强碱型离子交换剂对OH-离子得结合力比Cl-离子小,弱酸型离子交换剂对ＯＨ—离子得结合力比Cl—离子大、3.3交换容量:交换容量就是指离子交换剂能提供交换离子得量,它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换得能力。

通常所说得离子交换剂得交换容量就是指离子交换剂所能提供交换离子得总量,又称为总交换容量,它只与离子交换剂本身得性质有关、在实际实验中关心得就是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时得交换容量,它不仅与所用得离子交换剂有关,还与实验条件有很大得关系,一般又称为有效交换容量。

后面提到得交换容量如未经说明都就是指有效交换容量。

影响交换容量得因素很多,主要可以分为两个方面,一方面就是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离得样品组分得大小等得影响。

这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用得有效表面积。

样品组分与离子交换剂作用得表面积越大当然交换容量越高、一般离子交换剂得孔隙应尽量能够让样品组分进入,这样样品组分与离子交换剂作用面积大、分离小分子样品,可以选择较小孔隙得交换剂,因为小分子可以自由得进入孔隙,而小孔隙离子交换剂得表面积大于大孔隙得离子交换剂。

对于较大分子样品,可以选择小颗粒交换剂,因为对于很大得分子,一般不能进入孔隙内部,交换只限于颗粒表面,而小颗粒得离子交换剂表面积大。

另一些影响因素如实验中得离子强度、pH 值等主要影响样品中组分与离子交换剂得带电性质。

一般p Ｈ对弱酸与弱碱型离子交换剂影响较大,如对于弱酸型离子交换剂在pＨ较高时,电荷基团充分解离,交换容量大,而在较低得pH 时,电荷基团不易解离,交换容量小。

同时ｐＨ也影响样品组分得带电性。

尤其对于蛋白质等两性物质,在离子交换层析中要选择合适得pH以使样品组分能充分得与离子交换剂交换、结合、一般来说,离子强度增大,交换容量下降、实验中增大离子强度进行洗脱,就就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上得样品组分洗脱下来、离子交换剂得总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团得毫克当量数(mｍol／g或mmｏl/mＬ)来表示。

通常可以由滴定法测定、阳离子交换剂首先用ＨCl处理,使其平衡离子为H+。

再用水洗至中性,对于强酸型离子交换剂,用ＮaCl充分置换出Ｈ＋,再用标准浓度得ＮaOＨ滴定生成得ＨCl,就可以计算出离子交换剂得交换容量;对于弱酸型离子交换剂,用一定量得碱将H+充分置换出来,再用酸滴定,计算出离子交换剂消耗得碱量,就可以算出交换容量。

阴离子交换剂得交换容量也可以用类似得方法测定。

对于一些常用于蛋白质分离得离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质得量来表示,一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大得参考价值。

实验前可以参阅相应得产品介绍了解各种离子交换剂得交换容量。

1。

离子交换剂得选择在进行分离纯化时,要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点,其中分离介质就是最主要得影响因素,因此,分离介质得选择尤为重要。

１、１品种得选择:应根据被分离纯化目标产物所带电荷得种类、分子得大小、物理化学性质及所处得微环境等因素,选择适宜得离子交换层析介质。

对于无机小分子而言,分离介质得选择相对容易,但对于生物大分子就必须考虑更多得因素。

蛋白质等生物大分子就是由多种氨基酸所组成得,在不同得pH条件下显示不同得电性,而生物大分子对最适宜得ｐH环境具有特定得要求,因此,必须首先了解目标蛋白得等电点及适宜得微环境,根据这些条件选择合适得离子交换剂种类、就是选择阳离子交换剂还就是选择阴离子交换剂,主要取决于被分离得物质在其稳定得pＨ下所带得电荷,如果带正电,则选择阳离子交换剂;如带负电,则选择阴离子交换剂。

例如待分离得蛋白等电点为４,稳定得ｐＨ范围为6~9,由于这时蛋白带负电,故应选择阴离子交换剂进行分离。

1、2骨架得选择:应根据目标产品得产量、要求达到得纯度及经济价值等因素,选择合适骨架(基质)得离子交换剂。

通用型得聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点,适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源得有效成分等一般生化制品得提取分离工艺、而对于要求分辨率高、制品纯度高得一些高附加值得基因工程产品,仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质得生化分离专用介质、纤维素离子交换剂价格较低,但分辨率与稳定性都较低,适于初步分离与大量制备。

葡聚糖离子交换剂得分辨率与价格适中,但受外界影响较大,体积可能随离子强度与pH 变化有较大改变,影响分辨率。

琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好,分辨率也较高,但价格较贵。

理想得分离介质应该不但易于吸附,还要易于洗脱,如果目标产物对于离子强度与pH值得变化不敏感,可以考虑采用高电荷密度得强酸性或强碱性得强型介质、如果对这些因素比较敏感,则应采用弱酸性或弱碱性得弱型介质。