人角质形成细胞培养有新方法

生堡麈丛拄塞盍缝８生１２月筮垒！鲞筮１２魍￡丛！』旦婴墅！ｌ，旦盟￡坐照丛２鲤量ｙ丛！垒！，№．１２维生素Ｃ和烟酰胺对原代培养人角质形成细胞的影响王菲菲李红文吴景兰郑乃刚王一菱【摘要】目的探讨维生素ｃ和烟酰胺对原代培养人表皮细胞的增殖和分化的影响，为临床应用提供实验基础。

方法取正常人手术切除的包皮，应用热溶素分离表皮与真皮，以胰蛋白酶及ＥＤＴＡ分离表皮细胞为单个细胞。

以ＮＩＨ一３Ｔ３作为饲养细胞，单个表皮细胞培养于表皮完全培养基内。

将培养的人表皮细胞等分为三份；一份加维生素ｃ，一份加烟酰胺，另一份为完全培养液对照组。

应用免疫组化和蛋白质免疫斑点印迹阵列技术检测Ｃ—ｍｙｃ、细胞周期蛋白Ｄｌ、丝聚合蛋白及内披蛋白的表达情况。

结果各组集落数不同，维生素Ｃ组＞对照组＞烟酰胺组，维生素ｃ组的集落形态与对照组近似，而与烟酰胺组差异较大。

与对照组相比，维牛素ｃ组Ｃ—ｍｙｃ、细胞周期蛋白Ｄｌ、丝聚合蛋白及内披蛋白的表达均上调（Ｐ值均＜０．０５）；烟酰胺组丝聚合蛋门表达显著上调（Ｐ＜０．０１），内披蛋白表达变动不明显（Ｐ＞０．０５），而Ｃ—ｍｙｃ表达下调（Ｐ＜０．０５）。

结论维生索Ｃ对人角质形成细胞的增殖和分化均有促进作用。

烟酰胺对人角质形成细胞的分化有促进作用，但对其增殖却有抑制作用。

【关键词】角蛋白细胞；抗坏血酸；烟酰胺；细胞，培养的ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｖｉｔａｍｉｎＣａｎｄｎｉａｅｉｎａｍｉｄｅｏｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｆｍｏｅｙｔｅｓＷＡＮＧＦｅｉ．ｆｅｉ．ＬＩＨｏｎｇ－ｗｅｎ．、ⅣＵＪｉｎｇ－ｌａｎ．ＺＨＥＮＧＮａｉ－ｇａｎｇ，ｗＡＮＧＹｉ—ｌｉｎｇ．＂ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔ－ｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５００５２，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ＂ＬＩＨｏｎｇ－ｗｅｎ．Ｅｍａｉｌ：ｙｆｙｌｈｗ＠ｓｉｎａ．ｔｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖｉｔａｍｉｎＣａｎｄｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｆｆｅｒ－ｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＮｏｒｎｌａｌｈｕｍａｎｆｏｒｅｓｋｉｎｗａｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍｉｓｗａｓｓｅｐａｒａｔｅｄｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙｆｒｏｍｔｈｅｄｅｒｍｉｓｂｙｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ，ａｎｄｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍｉｓｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈｔｒｙｐｓｉｎｐｌｕｓＥＤＴＡ．ＴｈｅｓｉｎｇｌｅｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｕｎｄｅｄｙｉｎｇＮＩＨ．３Ｔ３ｃｅｌｌｓｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｉｅｄｗｉｔｌｌ５０ｍｇ／Ｌ（ｖｉｔａｍｉｎＣｇｒｏｕｐ）．ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅｏｆ４００ｉ山ｍｏｌ／Ｌ（ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅｇｒｏｕｐ）ｏｒｖｅｈｉｃｌｅ（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）．ＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｄｏｔｂｌｏｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｄｉｒｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔＣ—ｍｙｃ，ｃｙｃｌｉｎＤｌ，ｆｉｌａｇ－刚ｎａｎｄｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｏｌｏｎｙｎｕｍｂｅｒｗａｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎｖｉｔａｍｉｎＣｇｒｏｕｐ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅｇｒｏｕｐ，ａｎｄｔｈｅｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｉｎｖｉｔａｍｉｎＣｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ｂｕｔｄｉｓｔｉｎｃｔｆｒｏｍｔｈａｔｉｎｔｈｅｎｉａｃｉｎａｍｉｄｃｇｒｏｕｐ．ＡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｗａｓｎｏｔｉｃｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ．ｍｙｃ。

角质形成细胞原代培养的准备工作补充培养基的配制：（1）将0.5ml 浓度为0.06M 的CaCl 2加入到500ml 基础培养基中，则培养基中CaCl 2浓度为0.06mM ；（2）将5mlHKGS （人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养基中。

（3）向其中加入50ul 双抗（100x ），使培养基中双抗比例为1%。

胶原涂层培养瓶：（1）在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm 2的细胞培养瓶中先加入1.7ml 稀释液，再向其中加入17ul 胶原（培养面积为75cm 2的培养瓶先加5ml 稀释液，再加50ul 胶原）；（2）来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在室温下孵育30min 30min；；（3）从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C 备用。

消化液：0.025%0.025%胰酶胰酶胰酶+0.01%EDTA +0.01%EDTA可用可用(0.25%(0.25%(0.25%胰酶胰酶胰酶+0.1%EDTA)+0.1%EDTA)+0.1%EDTA)稀释十倍得到稀释十倍得到其中的百分比表示质量体积比，即0.25%0.25%胰酶表示胰酶表示0.25g 胰酶溶于100mlPBS 溶液；溶液；0.1%EDTA 0.1%EDTA 表示0.1gEDTA 溶于100mlPBS 溶液。

终止消化液：含10%10%血清的血清的DMEM 或含10%10%血清的血清的PBS 溶液冻存比例：80%80%含细胞的培养基含细胞的培养基含细胞的培养基+10%+10%+10%血清血清血清+ 10%+ 10%+ 10%含含DMSO 的冻存液皮肤角质形成细胞的原代培养复苏（1） 将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37°37°C C 温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其在2min 内完全融化。

人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。

方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。

结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。

结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。

[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。

随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。

人工皮肤的研制就是一个典型例子。

在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。

为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。

材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。

2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。

二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。

人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨[摘要]目的：研究不同配方及浓度的胰蛋白酶对人瘢痕角质形成细胞（keratinocyte，k）生物活性影响。

探索一种更适于瘢痕角质形成细胞原代培养消化的方法。

方法：温消化法分离瘢痕组织表皮、真皮后，分别采用0.1%胰蛋白酶和0.05%胰蛋白酶-0.025%edta 对表皮片进行消化，培养角质形成细胞，用台盼蓝染色法和24h细胞贴壁率观察k存活率及细胞活性。

结果：两种配方胰酶消化k，细胞存活率均达80%以上，结果无统计学差异(p＞0.05)。

与单独使用胰蛋白酶相比，经胰蛋白酶-edta组消化后的细胞贴壁率增加，结果有统计学差异(p＜0.05)。

结论：胰蛋白酶-edta能较温和地消化角质形成细胞，较大程度地保留细胞活性，与胰蛋白酶消化法相比，此方法更适合k的消化及培养。

[关键词]角质形成细胞；胰蛋白酶；乙二胺四乙酸[中图分类号]q813.1 [文献标识码]a [文章编号]1008-6455（2012）05-0762-02effect of different digestion methods on the hypertrophic scar derived keratinocytes culturejiang cai-li,nong xiao-lin(department of oral and maxillofacial surgery,college of stomatology,guangxi medical university,nanning530021,guangxi,china)abstract: objective to research the effect of different digestion methods acted on keratinocytes and obtain a better one. methods cultured keratinocytes derived from hypertrophic scar using digestion 0.1% trypase and 0．05% trypase with 0.025% ethlenediamine tetracetic acid (edta)．cell vigor was observed with teypane blue stained and calculated the adherence rate in 24 hours. results keratinocytes digested by different trypase showed over 80%survival rate．however,a significant difference was found on adherence rate in 24 hours (p＜0.05). conclusion digestion with 0．05% trypase mixed 0. 025% edta was better for cultivation of keratinocyte compared with 0.1%trypase using alone.key words:keratinocyte；trypase；edta在瘢痕研究中，笔者比较了两种不同的消化酶在培养原代瘢痕角质形成细胞时的效果，报道如下。

角质形成细胞源ＩＬ－1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响目的：研究角质形成细胞分泌的IL-1α对成纤维细胞生物学行为的影响。

方法：组织块法培养成纤维细胞，消化法培养角质形成细胞，采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的IL-1α；成纤维细胞中加入含不同浓度IL-1α抗体(0．04μg ／ml，0．2μg／ml，1μg／ml)的角质形成细胞条件培养液为实验组，含DMEM 的条件培养液为对照组，采用Cell counting kit-8、放免法测定成纤维细胞增殖、胶原合成。

结果：细胞爬片可见大量染色阳性角质形成细胞，细胞增殖测定，各实验组吸光度(A)值与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度增高，A值减小，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)；胶原分泌浓度测定，各实验组与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度及胶原浓度增高，0．2μg／ml及1μg ／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)。

结论：正常角质形成细胞分泌大量IL-1α，可促进成纤维细胞增殖，抑制胶原分泌。

标签：角质形成细胞；IL-1α；成纤维细胞；细胞增殖；胶原分泌通讯E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn角质形成细胞能够促进成纤维细胞增殖并抑制其胶原合成，这种作用是由角质形成细胞分泌的各种活性因子来实现的。

但角质形成细胞分泌的每一种因子对成纤维细胞到底有什么具体作用，现在研究的还不是很清楚。

IL-1α是角质形成细胞分泌的重要因子，可调节成纤维细胞大量基因的表达，影响多种生物活性因子合成与分泌，也是角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的一个主要因子。

但其对成纤维细胞的具体作用仍不明确，故我们对其进行了研究。

1资料和方法1．1材料：无血清角质形成细胞培养基(Keratinocyte-SFM，KSFM，Gibco 公司，美国)，DispaseⅡ酶(Gibco公司，美国)，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)放免试剂盒(海研所)，Cell countingkit-8(CCK-8，Dojindo，日本)，IL-1α抗体(R&D公司，美国)，生物素化兔抗山羊IgG和ABC 复合物(Vector公司，美国)。

皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察目的：从皮肤组织块培养获取原代细胞。

方法：将皮肤组织块修剪成2mmX 2mm大小，放置到培养皿中，真皮层向下，观察细胞爬出的情况。

结果：组织块培养第3天，有角质形成细胞从组织块爬出，第7天左右组织块周围出现黑素细胞，随着培养时间的延长，组织块周围出现大量成纤维细胞。

结论：在组织块培养过程中，早期可以收集较纯的角质形成细胞，含血清的DMEM培养20d后，可以得到大量成纤维细胞。

标签：组织块培养；原代细胞；前体细胞皮肤原代细胞的获得与培养对于基础和临床研究有着重要的意义。

然而，通过中性蛋白酶和胰酶消化将表皮细胞游离，然后进行细胞的贴壁培养，继而经差别胰酶消化将细胞纯化，得到的角质形成细胞容易受到成纤维细胞的污染。

在本实验中，通过皮肤组织块的培养方法，通过不同细胞从组织块爬出的时间不同，探索获得原代细胞的方法。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 包皮：包皮环切术中的包皮组织（提供者为18岁健康男性）1.1.2 试剂：中性蛋白酶（sigma），0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/LEDTA （吉诺牛物公司），人黑素细胞培养基（Medium 254）及黑素细胞牛长添加成分（human melanocyte growth supplement，HMGS）（包含5μg/ml胰岛素，50μg/ml 维生素C，6mmol/LL一谷氨酰胺，0. 20mmol/L氯化钙等），人表皮细胞无血清培养基，角质形成细胞牛长添加成分（humankeratinocytegrowthsupplement，HKGS）（0. 18μg/ml氢化可的松、0.20ng/ml EGF、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和8μg、ml霍乱毒素）（美国Invitrogen公司），胎牛血清（四季青）（浙江天航牛物科技有限公司），兔抗人Vimentin单克隆抗体（福州迈新牛物科技有限公司），GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（上海基因科技有限公司）。

原代角质形成细胞的分离培养方法原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。

原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，可以获得更准确的研究和数据。

为了更好的服务于广大科研工作者，赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法，技术因人而异仅供参考：角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。

根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。

基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。

角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。

在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。

细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。

需要的实验试剂：1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系4.基础培养基：DMEM/F125.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.46.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶9.75%医用酒精10.胎牛血清（FBS）实验器械：1.培养皿2.T-25细胞培养瓶3.100目不锈钢网筛4.200目不锈钢网筛5.眼科剪6.眼科镊7.离心管（15ml、50ml）实验步骤：1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。