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糖苷酶的异源表达及酶活表征专业：微生物学研究生：张鹏飞指导教师：王一丁摘要：目的及意义：在时代飞速发展，传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天，新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。
其中，以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源，它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂，还应用于工业生产和医疗卫生行业。
木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力，还能够带动经济增长。
但是，木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。
主要原因如下：1）组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底；2）纤维素降解发酵所需的酶产量过低，不能满足工业发展的大量需求；3）单一的糖苷酶降解效率较低。
因此，本研究旨在寻找多种高效糖苷酶，对其基因进行密码子优化和改造，以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白，并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。
以期达到对木质纤维素的高效利用。
材料方法：本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体，采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞，对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达，以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。
结果：目标蛋白在异源细胞中均成功表达。
三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为：5.5、5、4、4和4，均偏弱酸性，在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。
而最适反应温度及热稳定性存在差异：pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃，35℃和30℃以下较为稳定；C6的最适反应温度为60℃，40℃以下比较稳定；A10的最适反应温度为80℃，60℃以下较为稳定；pJL-44最适反应温度为60℃，25℃以下稳定存在。
糖苷酶的异源表达及酶活表征目的及意义:在时代飞速发展,传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天,新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。
其中,以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源,它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂,还应用于工业生产和医疗卫生行业。
木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力,还能够带动经济增长。
但是,木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。
主要原因如下:1)组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底;2)纤维素降解发酵所需的酶产量过低,不能满足工业发展的大量需求;3)单一的糖苷酶降解效率较低。
因此,本研究旨在寻找多种高效糖苷酶,对其基因进行密码子优化和改造,以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白,并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。
以期达到对木质纤维素的高效利用。
材料方法:本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体,采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞,对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达,以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。
结果:目标蛋白在异源细胞中均成功表达。
三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为:5.5、5、4、4和4,均偏弱酸性,在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。
而最适反应温度及热稳定性存在差异:pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃,35℃和30℃以下较为稳定;C6的最适反应温度为60℃,40℃以下比较稳定;A10的最适反应温度为80℃,60℃以下较为稳定;pJL-44最适反应温度为60℃,25℃以下稳定存在。
可以看出,相同来源的糖苷酶和不同来源的同工糖苷酶热稳定性和最适反应温度均不同。
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。
异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。
通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。
一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。
表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。
1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。
2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。
将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。
3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。
将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。
常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。
二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。
1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。
常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。
质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。
2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。
常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。
荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。
酶蛋白的异源表达的意义和作用
摘要：
1.茂名高新区简介
2.段晓红的个人背景
3.段晓红的工作经历
4.段晓红的教育经历
5.段晓红的成就和荣誉
正文：
茂名高新区，全名茂名高新技术产业开发区，位于广东省茂名市，是茂名市经济发展的重要载体。
其主要产业为石油化工、新型建材、电子信息等，区内企业众多，经济实力雄厚。
段晓红，女，1976 年出生，广东茂名人，大学本科学历，现任茂名高新区某企业高级工程师。
段晓红的工作经历丰富，曾在多家知名企业担任重要职务。
她的职业生涯始于1998 年，当时她在茂名一家石油化工企业担任技术员。
在此期间，她不仅积累了丰富的实践经验，还通过自学和参加培训，不断提升自己的专业技能。
2002 年，段晓红升任该企业的高级工程师，开始从事技术管理和研发工作。
段晓红的教育经历同样丰富。
她在1994 年至1998 年间，在广东某知名大学学习化学工程专业，并取得了本科学历。
在校期间，她不仅学习成绩优异，还积极参加各类学术活动和社会实践，锻炼了自己的组织协调能力和团队合作精神。
段晓红在事业上取得了一系列的成就和荣誉。
她曾多次获得企业的优秀员工和优秀工程师等荣誉，还被评为茂名高新区优秀科技人才。
她的多项科研成果也被企业和行业协会认可，并在行业内推广应用。
人羧肽酶b的异源表达,纯化及其酶活研究全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人羧肽酶B（carboxypeptidase B，CPB）是一种重要的胰脾酶家族成员，具有在肽链C端切除氨基酸的功能。
CPB在体内参与多种生理过程，如蛋白质降解、消化和免疫调节等。
由于其重要性，对CPB的研究已经引起了广泛关注。
CPB的异源表达、纯化和酶活研究一直是研究者面临的挑战之一。
本文将重点讨论关于人羧肽酶B的异源表达、纯化及其酶活研究的最新进展。
一、异源表达人羧肽酶B的异源表达可以利用细胞培养技术，如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
大肠杆菌是一种常用的表达系统，因为其生长快速、易于操作、表达量高等优点。
通常通过将CPB基因克隆到表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行表达。
值得注意的是，CPB的表达量和纯度受到多种因素的影响，如表达宿主的选择、表达条件的优化等。
二、纯化表达获得的融合蛋白需要进行纯化才能得到纯净的CPB。
传统的CPB纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
近年来，随着蛋白质工程技术的进步，一些新的纯化方法也被应用于CPB 的纯化，如亲和抓卡技术、蛋白质组学方法等。
这些新方法在提高纯化效率、减少操作步骤和成本等方面具有明显优势。
三、酶活研究人羧肽酶B的酶活研究是对其生物活性和功能的理解的关键。
酶活性通常通过对底物的降解速率进行测定来评估。
对CPB的底物特异性、抑制剂活性等也是酶活研究中的重要内容。
通过对CPB的酶活性进行研究，可以深入了解其在生理和病理条件下的作用机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。
人羧肽酶B的异源表达、纯化及其酶活研究是对其功能和应用进行深入探究的重要方向。
随着技术的不断进步，相信对CPB的研究将会取得更多突破，为相关领域的发展带来新的机遇和挑战。
第二篇示例：人羧肽酶B（CPB）是一种重要的内源性蛋白酶，广泛存在于哺乳动物细胞中，扮演着调控蛋白质的降解、修复和合成等生理功能的关键角色。
碳酸酐酶异源表达及在微藻中co2固定作用机制的研究
碳酸酐酶是一种重要的酶，主要参与细胞的光合作用。
在微藻的碳循环过程中，它可以解
偶联碳酸二氢酯和氧化碳。
在近年来，随着生物技术的发展，碳酸酐酶异源表达在生物技
术中发挥着重要的作用。
首先，碳酸酐酶在细胞光合作用中起着关键作用。
碳酸酐酶可以将脱氢的碳酸二氢酯和氧
化碳分解成两个简单的细胞代谢物──3-羟基色氨酸和羧酸。
细胞中的二氧化碳主要来自
呼吸而来，碳酸酐酶可以将碳氧化以及提供生物再生能力，促进了细胞的光合作用，可以
为细胞提供可燃物和能量。
其次，碳酸酐酶异源表达在微藻CO2固定方面也发挥着重要作用。
细藻是一种重要的CO2
吸收者，具有细胞内呼吸和光合作用的隐藏能量，可以为碳固定过程提供高水平的效率。
针对碳酸酐酶的异源表达，许多研究表明在微藻碳酸酐酶多基因异源表达系统中，可以实
现有效的碳固定作用。
此外，在特定背景基因水平上表达某些碳酸酐酶基因，其碳固定作
用可以提高，这也是近期研究的热点。
最后，在碳酸酐酶异源表达的研究中，一些新的策略也在开发当中。
比如，利用不同于现
有碳酸酐酶异源表达的转录调控因子来调控碳固定作用；或者改变表达的目的基因的结构，使微藻更容易摄取和利用碳源；另外，也可利用遗传变异等方法来提高碳固定作用，而这
些也是需要进一步探讨的研究方向。
总之，碳酸酐酶在细胞光合作用和微藻CO2固定方面发挥着重要的作用，碳酸酐酶异源表
达的研究也在不断发展。
随着研究的深入，我们有望将碳酸酐酶的异源表达技术应用到微
藻CO2固定方面，从而促进微藻的发展。
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因
另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：
1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达
这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是
2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达
这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括
(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等
(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种
(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了
异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：
1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。
但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。
蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。
但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。
昆虫细胞和动物细胞本
人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！
另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。
不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义，我们实验室就有很多人在做这方面研究。
2. 转化子、表达子的筛选
转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。
但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。
我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。
但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。
还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。
请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。
不知有没有解决的方法。
不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
3. 稀有密码子
由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。
下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。
首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。
我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。
他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA 是否转录了；
再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。
如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA 转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结
构的问题了。
然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。
在这个问题上我试着查了一些网站，如http://www.kazusa.or.jp/codon/ ；http://gcua.schoedl.de/ ；http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。
等等。
但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。
希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。
在此感谢了！
接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。
当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
4. 菌种的保存、退化
一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。
但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。
连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。
我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。
我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。
有没有其他解决方法呢？盼高手。
5. 拷贝数对表达量的影响
对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。
那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。
在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。
但是我曾
经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。
当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试。
