表达异源基因的方法及其所用的载体

分子生物学zuq题库６３转基因动物的应用：（１）对基因组织或时期特异表达的研究（２）通过研究转入外源基因后的新表型，能够发觉基因的新功能；（３）导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，能够发觉新的基因（４）可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究（５）建立研究外源基因表达、调控的动物模型（６）对遗传性疾病的研究（７）建立人类疾病的动物模型，（８）动物新品种的培养（９）基因产品的制备（１０）在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。

６４转基因植物技术路线：（１）选择及获得外源目的基因，（２）受体细胞培养，（３）选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞（４）将转化细胞进行适当培养（５）选择阳性转化细胞（６）培植阳性转化植株（７）转基因植株的鉴定。

６５转基因植物在医学上的应用：（１）可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源（２）因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。

（３）还可产生单抗，作为化疗药物的靶向载体。

６６基因打靶的必备条件：（１）胚胎干细胞：ＥＳ细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。

体外培养要坚持细胞的分裂增殖与正常的核型，同时抑制细胞的分化。

（２）打靶载体：a、neo阳性选择标志：b、ＨＳＶ－tk阴性选择标志：６７构建打靶载体的差不多过程：（１）获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ片段克隆到一样的质粒载体中；（２）从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；（３）将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；（４）在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将ＨＳＶ－tk基因克隆到此线性载体中。

６８ＤＮＡ芯片技术的应用：（１）ＤＮＡ序列测定（２）基因表达分析（３）基因组研究（４）基因诊断（５）药物研究与开发（药物选择、新药发觉、合理用药、中草药鉴定和真假药辨不）６９引起ＤＮＡ一级结构变异的诱变剂的作用机制：（１）碱基类似物诱发突变（２）改变ＤＮＡ的化学结构（３）结合到ＤＮＡ分子上诱发移码突变（４）紫外线及其其它射线引起的ＤＮＡ分子变化。

异源表达异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合⽬的基因另外重组⼯程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。

以质粒的形式存在于菌体⾥，以质粒表达这种⼀般保存还是容易的，多数情况下⽤抗⽣素压着就问题不⼤，⽽且直接⽤质粒保存，⽤时现转也能顺利表达的情况也有的是2。

重组在宿主基因组中，与宿主蛋⽩⼀起表达这就保存起来⽐较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿⼏代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插⼊的位点在宿主基因组的⾮活跃区域，过⼏代就基因沉默了。

⼀般个⼈认为可以⼀试的⽅法包括(1)⽤抗⽣素传代、保菌后抗⽣素复苏等等(2)得到⼯程菌后第⼀代就保10管，取⼀管传⼀代再保10管，再取⼀管做使⽤菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，⼏⼗个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜⼀般没那个精⼒)还能保留表达能⼒的算相对⽐较稳定了异源蛋⽩的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，⽽且由于蛋⽩本⾝千差万别，很难有⼀个很完善或很标准的流程⽅法。

另外，表达的宿主也是多种多样，⽬前⽐较常⽤的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃有着其本⾝的特点，优缺点各异。

但是，异源表达⼜是分⼦⽣物学中很重要的⼀个⼯具，园⼦⾥不少战友都在做这⽅⾯的⼯作，许多帖⼦在讨论这⽅⾯的问题。

因此想发起⼀个针对这⽅⾯的专题讨论，希望有助于⼤家的⼯作，当然也希望能对⾃⼰的⼯作有所帮助，欢迎⼤家讨论。

还有，由于本⼈只做了有关E.coli和甲醇酵母的⼯作，其他虽然我们研究所也有⼈做，但毕竟本⾝没做过，若有错误或不严谨的地⽅欢迎战友们指正。

⾸先在这⾥提出⼏⽅⾯问题，希望⼤家讨论：1. 宿主的选择。

表达宿主虽众多，但⽐较常⽤的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃代表了⼀种体系。

基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。

寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。

特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。

关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。

基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。

比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。

寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。

差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。

差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。

通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。

分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。

笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。

1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。

具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。

漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展刘晓庆;那日;郭九峰【摘要】近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景,对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视.然而,自然界漆酶的产量和酶活较低,难以适应工业化生产需求.此外,漆酶的产酶效率低,成本高.实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径.目前,国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆,并在不同的宿主细胞中实现异源表达,但迄今为止漆酶基因异源袁达结果仍然不理想,离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】漆酶;宿主细胞;异源表达;基因克隆;酶活性【作者】刘晓庆;那日;郭九峰【作者单位】内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(laccase，Ec1.10.32)属于含铜的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物。

真菌和植物中都可以分泌漆酶，少数的昆虫和细菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生产者。

它通过获得O2对苯酚物质进行催化作用，而生成物中仅有水。

漆酶是一种不可多得的环保型氧化酶。

漆酶是参与自然界木质素循环与利用的重要酶之一。

漆酶对富含木质素的农作物残渣的有效降解作用不仅可以减少秸秆焚烧带来的环境问题，而且可以提高青贮饲料的品质和利用率，对与木质素结构相似的污染物也有明显的降解能力。

据统计，漆酶有作用底物250多种[1]1。

漆酶的底物多样性决定了它是一种多功能氧化酶。

它在工业、农业及食品工业都有着极其广泛的应用。

近年来研究表明，漆酶在生物技术方面也有重要的作用，可用于生物传感器与生物检测。

自考医学考试分子生物学(习题卷4)第1部分：单项选择题，共85题，每题只有一个正确答案,多选或少选均不得分。

1.[单选题]Lac阻遏蛋白结合乳糖操纵子的（ ）A)CAP结合位点B)O序列C)P序列D)Z基因答案:B解析:2.[单选题]下列哪一种质粒属于耐药性质粒?（ ）A)F质粒B)R质粒C)col质粒D)质粒噬菌体答案:B解析:3.[单选题]培养液中，影响腺苷酸环化酶的活力，使细胞内cAMP的活力下降，从而抑制LAC操纵子的转录的原因是由于存在A)乳糖B)葡萄糖C)半乳糖D)果糖答案:B解析:4.[单选题]密码子存在于A)DNAB)rRNAC)mRNAD)tRNA答案:C解析:5.[单选题]大肠杆菌DNA复制的延伸过程中，起主要作用的酶是A)DNA聚合酶Ⅲ全酶B)DNA聚合酶IC)DNA聚合酶ⅡD)引物酶答案:A解析:C)核糖体+蛋氨酰tRNA+mRNAD)翻译起始因子+核糖体答案:C解析:7.[单选题]下列不属于PCR体系的基本成分是A)DNA或RNA模板B)特异性引物C)核苷三磷酸(NTP)D)缓冲液答案:C解析:8.[单选题]下列不属于小分子RNA的是A)hnRNAB)snRNAC)scRNAD)miRNA答案:A解析:9.[单选题]顺式作用元件的形式不包括A)密码子B)增强子C)CAAT盒D)GC盒答案:A解析:10.[单选题]下列不属于顺式作用元件的是A)启动子B)转录因子C)终止子D)衰减子答案:B解析:11.[单选题]下列哪一种酶在DNA复制述程中具有校读作用A)DNA聚合酶IB)DNA聚合酶IIC)DNA聚合酶IIID)DNA解旋酶答案:A解析:12.[单选题]下列不属于细胞凋亡的特征是A)出现炎症反应B)出现凋亡小体13.[单选题]通过对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因矫正过程称为A)碱基修复B)基因转换C)重组修复D)基因修复答案:A解析:14.[单选题]聚合酶链反应有三个基本步骤组成循环反应，它们是变性、和延伸。

米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究宋婷婷;吴珍珍;宗红;陆信曜;诸葛斌【摘要】通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用.结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0 ～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn2+和Ca2+对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活.以Asp-pNA为底物时,Km为0.42 mmol/L,Vmax为21.57 μmol/(mL·min),该酶具有水解Nv末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性.重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】7页(P38-44)【关键词】米曲霉;天冬酰胺氨肽酶;酶学性质【作者】宋婷婷;吴珍珍;宗红;陆信曜;诸葛斌【作者单位】糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122;糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业微生物研究中心,江苏无锡,214122【正文语种】中文米曲霉(Aspergillus oryzae)具有强大的蛋白分泌能力和公认的食品安全性，是传统豆酱、酱油等酿造工业的重要菌株[1]，其分泌的蛋白酶能够将蛋白质水解成多肽及氨基酸，增强酿造食品的味道和风味[2-3]。