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基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
一、名词解释1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
2、载体：是指携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
即指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。
3、LacZ’基因：编码b-半乳糖酶的a-肽链，即氨基末端。
4、多克隆位点区域片段：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
可以定向克隆防止载体自我连接。
5、溶菌周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面之后，注入DNA，噬菌体的DNA进行复制及蛋白质的合成，并组装成噬菌体颗粒，最后使寄主细胞裂解，释放出子代噬菌体颗粒的过程6、杂交技术：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。
目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。
7、生物芯片：将细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，通过微加工技术及微电子技术集中点在一个小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、大信息量检测分析。
8、蛋白质融合表达：是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。
9、植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。
10、基因治疗：经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。
广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。
10、转基因动物（transgenic animals．．．．．．．．．．．．．．．．．）：通过基因转移技术获得的整合有外源基因的动物个体。
二、填空题1、质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。
基因工程知识点总结一、基因工程的概念基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
简单来说，基因工程就是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
二、基因工程的工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
2、特点：能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3、作用结果：产生黏性末端或平末端。
（二）“分子缝合针”——DNA 连接酶1、分类：E·coli DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。
2、作用：将两个具有相同末端的 DNA 片段连接起来。
（三）“分子运输车”——载体1、作用：将目的基因送入受体细胞。
2、具备条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。
具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。
具有标记基因，便于筛选。
3、种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
其中质粒是基因工程中最常用的载体。
三、基因工程的基本操作程序（一）目的基因的获取1、从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
基因组文库包含了一种生物的全部基因；cDNA 文库只包含了一种生物的部分基因，是由 mRNA 反转录得到的 DNA 组成。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
原理：DNA 双链复制。
条件：模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）等。
3、人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
（二）基因表达载体的构建（核心步骤）1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
分子生物学基因表达知识点梳理基因表达是分子生物学中的核心概念之一，它涉及到遗传信息从DNA 到蛋白质的传递过程。
这一过程的精准调控对于生物体的生长、发育、适应环境以及维持生命活动的正常运转都至关重要。
基因表达的第一步是转录。
在细胞核中，DNA 双螺旋结构解开，其中的一条链作为模板，在 RNA 聚合酶的作用下合成 RNA 分子。
这个 RNA 分子被称为信使 RNA（mRNA），它携带了从 DNA 上转录下来的遗传信息。
转录过程并非随意进行，而是受到特定的调控序列的控制。
启动子就是其中一个关键的调控元件，它位于基因的上游，能够被 RNA 聚合酶识别并结合，从而启动转录。
增强子则可以增强基因的转录效率，虽然它们距离基因较远，但可以通过与特定的蛋白质相互作用来影响转录。
转录完成后，新生成的 mRNA 分子需要经过一系列的加工才能成为成熟的 mRNA。
这包括 5'端加上帽子结构（7-甲基鸟嘌呤），3'端加上多聚腺苷酸尾巴（poly(A) tail），以及切除内含子、拼接外显子等。
这些加工步骤有助于 mRNA 的稳定、转运和翻译。
mRNA 从细胞核中出来，进入细胞质中，与核糖体结合，开始翻译过程。
在翻译过程中，tRNA 分子起着关键作用。
tRNA 一端携带特定的氨基酸，另一端具有反密码子，可以与mRNA 上的密码子互补配对。
核糖体沿着 mRNA 移动，每次读取三个碱基，称为一个密码子。
每个密码子对应一种特定的氨基酸。
在核糖体中，氨基酸通过肽键连接形成多肽链。
基因表达的调控是一个非常精细和复杂的过程。
在转录水平上，除了启动子和增强子的作用外，还有转录因子的参与。
转录因子可以结合到 DNA 上的特定序列，促进或抑制转录的进行。
在转录后水平，mRNA 的稳定性也会影响基因表达。
某些microRNA（miRNA）可以与 mRNA 结合，导致 mRNA 的降解或抑制其翻译。
在翻译水平上，核糖体的活性、tRNA 的可用性以及起始因子和延伸因子的作用都会影响翻译的效率。
第八章：基因工程与体外表达基因工程：是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节元件（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。
第一节：基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme）1.定义：它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。
2．限制性内切酶的命名：EcoRⅠ：E代表Escherichia属；co 代表coli种；R代表RY13株3．限制性内切酶的识别和切割位点：通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrome）的DNA 片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky end）。
如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：二、其他常用的工具酶1. DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase I)：有聚合酶活性；有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性；有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性2. DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)：为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
有5ˊ→3ˊ聚合酶活性；有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性；无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。
Klenow片段的主要用途：(1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。
(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。
(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。
(4) DNA序列分析。
3. 逆转录酶（reverse transcriptase）：是一种RNA依赖的DNA 聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。
用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。
4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）：T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。
5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。
制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。
6. 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。
作用：是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。
第二节：基因克隆的载体载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制或表达的DNA 分子。
一、常用的克隆载体(一)质粒（plasmid）性质：是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。
（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
(二)λ噬菌体：野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。
λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。
目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。
(三) M13噬菌体(M13 phage)：一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。
感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。
复制型M13可用作克隆载体。
(四)黏性质粒（cosmid）：是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。
其克隆容量可达40～50 kb。
(五) 病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。
多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。
二、表达载体(一) 原核表达载体：表达载体中含有复制起始位点、抗性基因、克隆位点、启动子、核糖体结合位点和转录终止信号(二) 真核表达载体：载体中含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号和poly (A) 加尾信号.第三节：基因克隆的基本过程基因克隆主要分为以下几个步骤：①制备目的基因和相关载体；②将目的基因和有关载体进行连接；③将重组的DNA导入受体细胞；④DNA重组体的筛选和鉴定；⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
一、目的基因的获得①从基因组文库中获得一个生物体的基因组ＤＮＡ用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段克隆在载体ＤＮＡ分子中,所有这些插入了基因组ＤＮＡ片段的载体分子的集合体,将包含了这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生物体的基因文库。
②从cDNA文库中获得：cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆。
③用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段。
④人工合成。
二、载体的选择与准备几种常用克隆载体的比较比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量<10 kb <22 kb 40～50 kb <1 kb基因组DNA文库- + + - cDNA文库+ + - -亚克隆+ - - +序列分析+ + - +E.coli表达+ + - -三、DNA分子的体外连接①黏性末端；②人工接头的使用；③加入同聚体尾；④平端连接四、外源DNA导入宿主细胞重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有以下几种。
（一）转化（transformation）转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。
转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。
大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（0～5℃）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。
（二）感染（infection）λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。
（三）转染（transfection）转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
常用的方法有电穿孔法（electroporation）、CaPO4沉淀法、脂质体融合法等。
进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。
五、目的基因的筛选和鉴定将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。
（一）遗传学方法1.插入灭活法2.蓝-白筛选（α互补）：许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点。
这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。
宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。
如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。
（二）免疫学方法：如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。
（三）核酸杂交法：对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。
（四）PCR技术：PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。
（五）酶切鉴定：用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。
1.插入片段大小的鉴定；2.插入片段方向性的鉴定第四节：真核细胞转染一. 真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）：使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。
（二）电穿孔法（electroporation）：将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。
（三）DEAE-葡聚糖法：外源DNA或重组质粒DNA与DEAE 葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。
此法简单、快速、有效，常用于外源基因的短暂表达研究。
（四）脂质体介导的基因导入（五）显微注射法（microinjection）二. 转染细胞的筛选（1）TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP合成途径：①从头合成：可被氨基喋呤阻断②补救合成：胸苷激酶(TK)是关键酶TK+: 细胞生长；TK- 细胞+含TK基因的载体:细胞生长。
（2）药物筛选转染细胞：哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括细菌新霉素抗性基因（neor）。
此基因具有对氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）的抗性。
G-418是用于阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。
如果将带有neor基因的质粒导入细胞，并在含有G-418的培养基中培养，未转染的细胞被杀死，而存活的细胞便是转染细胞。
第五节：基因的改造①寡核苷酸介导的定点诱变法的建立；②含U模板法；③PCR 定点诱变法第六节：克隆基因的表达基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。
得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。
在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。
Kozak序列：Kozak发现脊椎动物起始密码子ATG周边的序列为ANNATGG，-3位的A对翻译效率非常重要. 该序列被称为Kozak序列.基因表达：ＤＮＡ－ＲＮＡ－蛋白质功能蛋白质的形成：蛋白质折叠；磷酸化修饰；糖基化修饰；酰基化。
