质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝
松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。
穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达
②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。
③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。
蓝白斑筛选的机理
由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色
诱导培养基上只能形成白色菌落。
在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。
这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提
取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析
蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。
mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体
包涵体表达形式的优点1能简化外源基因表达产物的分离操作：2能在一定程度上保持表达产物的结构稳定3对宿主细胞无伤害4外源蛋白表达高
包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。
(以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如果未进行特殊设计，外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在
分泌型异源蛋白的表达：在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
分泌表达形式的优点)：1目的蛋白稳定性高2目的蛋白易于分离3目的蛋白末端完整
分泌表达形式的缺点)：大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全，信号肽并非总是有助于蛋白质的转运，有可能形成包涵体。
分泌型目的蛋白表达系统的构建：只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。
融合型异源蛋白的表达：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。
以融合形式表达目的蛋白的优缺点1目的蛋白稳定性高2目的蛋白易于分离3目的蛋白表达率高4目的蛋白溶解性好5目的蛋白需要回收(缺点)
融合蛋白表达质粒的构建原则）：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件外。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架
大肠杆菌表达外源基因的优势
1全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
2基因克隆表达系统成熟完善
3繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
4被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
1、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？
只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性
①识别序列的特异性：识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列
②切割位点的特异性：在识别序列内或附近特异切割。
3、DNA连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何利用价值？
作用特点：①不能连接两条单链DNA或环化DNA，只能连接双链DNA分子的单链缺口。②只能连接失去一个磷酸二酯键形成的单链断裂，不能连接缺失一个或多个氨基酸缺口③只作用于3端羟基和5端磷酸的链④连接反应需要ATP或NAD+和Mg2+
利用价值：可对缺口DNA，平末端DNA，黏性末端DNA进行连接。
载体：能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。
质粒载体：存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主复制闭合环状的DNA分子，整合或表达的工具。
噬菌体载体：应用噬菌体作为载体，广泛应用于大片段DNA克隆和文库构建的一类载体，代表有λ类噬菌体载体，M13噬菌体载体。
RNAi：RNA干扰，是双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。
VIGS：病毒诱导的基因沉默，是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。
1、克隆载体必须满足那些基本条件？
基本条件：①具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；②能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；③具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入；④具有合适的选择性标记，用于筛选。
2、质粒具有那些特征？
特征：①独立复制性：质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区，能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。
②质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存
③转移性：其含有tra基因，能指令宿主细胞与受体细胞结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。
④携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如物质抗性和物质合成。
3、你认为理想的载体应该是怎样的？如何设计？
理想的载体：①分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段；②能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制；③要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点，MCS）；④有适合的标记，易于选择；⑤有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；⑥从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
设计：①加入合适的选择标记基因②增加或减少合适的酶切位点③缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量④改变复制子，变严谨为松弛，变少拷贝为多拷贝⑤根据基因工程的要求，假装特殊的基因元件
基因工程定义：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组DNA分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。上游技术：（狭义基因工程）外源基因重组、克隆和表达的设计与构建
下游技术：（广义基因工程）含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。
基本过程：（操作）从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（切）用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。
（接）目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。
（转）把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。
（选）筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表
基因工程的四大要素：目的基因、载体、工具酶、宿主细胞。
限制性内切酶的概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并由此处切割DNA双链结构的核酸内切酶。
限制性内切酶的类型：I型：修饰限制类型：多功能；蛋白质结构：异源三聚体；辅助因子：ATP Mg2+ SAM；识别序列：TGAN8TGCT AACN6GTGC（单链）; 切割位点:距识别序列1kb 处随机性切割。II型：修饰限制类型：单功能；蛋白质结构：同源二聚体；辅助因子 Mg2+；识别序列：旋转对称；切割位点：识别序列内部，或附近特异性切割。III型：修饰限制类型：双功能；蛋白质结构：异源二聚体；辅助因子：ATP Mg2+ SAM识别序列：GAGCC CAGCAG；切割位点：距识别序列下游24-26bp处单链切割
II型限制性内切酶的特点：H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来分离的第一个酶Hind Ⅱ。每种Ⅱ型酶通常只有一种多肽,并以同源二聚体的形式存在。
(1)识别并切割特定的核苷酸序列，该序列称为核苷酸内切限制酶的识别序列，又称靶子序列、切割位点。
(2)不同的酶具有不同的识别序列，这些序列一般由4-8个核苷酸组成，并成回文结构
（Palindromic）即双重旋转对称的结构形式，也称二重对称结构
(3)不同的酶水解DNA双链切点处的葡萄糖磷酸二酯键，从而导致链的断裂，产生特定
的酶切末端--粘性末端（sticky end ，cohensive end）或平末端（blunt end）
影响酶切活性的因素（Ⅱ型限制性内切核酸酶酶切体系的建立）：内因：星星活性、底物甲基化和底物的构象。（构象的影响主要是指切割线性DNA和超螺旋DNA使得活性差异）DNA 的纯度、浓度外因：可预见，可控制的，如反应条件，底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等。其他的原因：酶切反应的体积、适当的延长反应的时间、加大酶的用量、缓冲液的的选择：提供稳定的PH、Mg2+ DDT（二硫苏糖醇）BSA（小牛血清）后两者都是保证酶切的稳定性。反应的温度，应当在最适反应温度大部分都是在37℃。反应时间：通常为一小时或者更多，适当延长反应时间可以减少酶的用量。
位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现除偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现除不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱（site preference）
星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性（star activity）
DNA聚合酶的定义：DNA聚合酶(DNA polymerase)的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性
DNA聚合酶所具有的活性：（1）DNA聚合酶的5‘→3’聚合活性DNA聚合酶最主要的活性（2）DNA聚合酶的3‘→5’外切核酸酶活性：从3’→5’方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种校对功能是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的（3）DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性：从DNA链的5'端向3'末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5'端的RNA引物也是必须的。
噬菌粒载体：由质粒载体和单链噬菌体载体结合而发展成的一种载体系列。
考斯质粒（COS）：一类人工构建的含有 -DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体
酵母人工染色体载体：利用酵母的染色体的复制元件构建的载体。
分子杂交的概念：分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量Southern杂交的操作步骤：一、预处理1.用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。2.将酶
切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。3.将电泳出来的那块凝胶泡在强碱溶液中，使双链解旋变成单链DNA。4.用酸中和，使单链DNA维持其状态。二、原位转移：将凝胶上的dsDNA 转移到滤膜上。三、固定：在真空烤箱里，80℃下烤 1~2个小时将核酸样品进一步固定在滤膜上。四、杂交：将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。五、漂洗：将滤膜上没有和单链DNA样品结合的右利的探针分子漂洗下来，滤膜上只剩下杂交分子。六、放射自显影：在X光曝射下进行放射自显影形成的自显影照片。七、比较鉴定：将放射自显影图片上的谱带进行比较。确定与分子探针接合的DNA分子是凝胶上DNA链上的哪个片段。
Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法
Western杂交：是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白
PCR技术及其应用：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR):简称PCR，是一种在体外扩增特定DNA序列的技术程序。包括DNA的变性、复性及多核苷酸合成三个步骤组成的多次反复的循环。成分包括：模板DNA、引物、高温DNA聚合酶、dNTP、Mg2+
基本原理：模板DNA变性→引物与DNA复性→引物DNA延伸，进入下一个循环，再到模板DNA变性。
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。
PCR的特点：1.高灵敏度性。2.性扩增。3.操作简单易行 4应用范围广泛。
基因文库：一种载体分子上随机克隆着某种生物的组织、器官、细胞类型的所有DNA片段而构成的一种克隆复合体，理论上它应该包括该生物全部的遗传信息，它分为基因文库和cDNA 文库。
基因组文库：指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力切割成一定长度范围的的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化成相应的宿主细胞获得所有阳性菌落，这个群体就称为该生物的基因文库。
基因组文库的构建：1.基因组DNA的制备2.基因组DNA的片段化与分级分离3.载体与受体的选择与制备4.载体与外源片段的连接形成重组DNA分子5.重组DNA导入受体细胞6.重组克隆的挑选与保存7.从基因文库中筛选目的基因。
cDNA基因文库：将生物的某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞，这种方法形成的所有克隆的集合体叫做cDNA文库
cDNA基因文库的构建：1.细胞总的RNA的提取和mRNA的分离2.第一条cDNA的合成3.第二条cDNA的合成4.双链cDNA克隆进如质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
cDNA文库的特点:不含内含子序列，可以在细菌中直接表达，包含了所有编码蛋白质的基因，比DNA文库小的多容易构建。
质粒的拷贝数：指质粒在复制时与宿主的繁殖相结合，致使每个细胞中只有一个或几个质粒，质粒在细胞中的拷贝数为10~200个。
转化：是指将外源DNA引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，
感受态细胞：是指具有吸收裸DNA分子能力的细胞，通常经一系列的处理方式可使得细胞
膜的通透性发生改变，而使细胞成为感受态细胞。
受体细胞：是指转化的对象，接受重组DNA的细胞，通常要求有高转化率，能保持质粒稳定，属某营养缺陷型，具其他选择标记等条件。
S-D序列：细菌mRNA翻译起点上游与16SrRNA相结合的序列。
退火：是指PCR等核酸分子重组过程中，即DNA加热变性后逐渐冷却的过程，
基因工程的研究内容1．特定目的基因的分离或合成2．构建重组DNA分子3．转化宿主细胞4．筛选重组DNA菌落5．目的基因的有效表达
制备外源DNA片段可以有以下5个途径：
第一，从生物基因组群体中分离目的基因（鸟枪法即限制性内切酶法、反转录法）
第二，人工合成
第三， PCR反应合成DNA
第四， mRNA差异显示法获得目的基因
第五，机械的方法如超声波把基因组打成片段。
工具酶：基因工程中进行基因的剪切、拼接、组合所需的酶统称为工具酶
工具酶按功能分为剪切酶、修饰酶、连接酶
影响限制性内切酶活性的主要因素：
1.酶的纯度
2.DNA样品的纯度
3.DNA的甲基化程度
4.酶切反应的温度与时间
5.DNA分子的构型
6.反应缓冲
常用的聚合酶有三种：即依赖DNA的DNA聚合酶；依赖RNA的DNA聚合酶；依赖DNA的RNA 聚合酶。
质粒的三种构型：共价闭合环状DNA（cccDNA)、开环DNA（ocDNA)、线形DNA（LDNA)
为什么要质粒质粒载体的构建？
1、天然质粒的局限性
（1）分子量大，拷贝数低
（2）筛选标志不理想
质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点
（4）具有较小的分子质量和较高的拷贝数
核酸的提取与纯化的三大步骤:
1.细胞破碎
2.去除与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质,
3.除去其他杂质核酸
SDS法的基本原理：利用高浓度SDS在较高温度（55-65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀（通常是加入5M的乙酸钾于冰上保温，在低温条件下乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物）。离心除去沉淀后，对上清液中的核酸进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。基因组文库与cDNA文库的区别：从定义上看，基因组文库指某种细胞内的某个基因组按一定长短要求被酶切成若干片段，与合适的载体分子重组，引入相应的细胞，形成的一大批含DNA重组体的细胞克隆群体，这样的细胞克隆群体称为基因组文库cDNA文库指以生物体RNA 通常是mRNA为模板，经逆转录酶作用形成cDNA再予以克隆而形成的一种基因文库。就真核生物的基因而言，mRNA前体经加工，去除内含子，且加尾polyA成为成熟mRNA，故cDNA 文库与基因组文库对照可用于研究内含子在基因中的位置及功能。
理想的分子标记：
1.高多态性
2.共显性遗传
3.能明确辨别等位基因
4.遍布整个基因组
5.无基因多效性
6.检测手段简单快速
7.成本低廉 8.重复性好
原位杂交内容
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交，即菌落杂交。
具体过程：将菌落或噬菌斑转移到溶菌液中的硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA同滤膜杂交。这些带DNA印记的滤膜烤干后，再与放射性同位素标记的特异性DNA或RNA探针杂交。漂洗除去未杂交的探针，同X光底片一道曝光。根据放射自显影揭示的同探针序列有同源性的DNA印迹位置，对照原来的平板，即可挑选出含插入序列的菌落或噬菌斑。差异杂交（differential hybridization）是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。
3．如何选择分离纯化重组蛋白的方法？
要针对外源基因表达目标蛋白的形式和性质来选用不同的分离纯化策略和方法。主要根据蛋白质的性质和在受体细胞中的位置制定分离纯化策略。如分泌型表达重组蛋白需要先沉淀浓缩再进行纯化，而天然蛋白则用层析较好。
1．PCR出现假阳性原因
1.引物设计不合适；选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。靶序列太短或引物太短导致特异性不强。
解决方案：选择特异性强的区段设计引物
2.靶序列或扩增产物的交叉污染。
（1）整个基因组或大片段的污染；操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（2）空气中的小片断核酸污染。这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。
解决方案：运用巢式PCR来减轻或消除
2.出现非特异扩增带原因
1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；
2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多；
3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。
解决方案：1.必要时重新设计合成引物；2.减低酶量或调换另一来源的酶；3.降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数；4.适当提高退火温度或采用二温度点法（94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸）。
3.PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素：1.模板中含有杂蛋白；2.模板中含有Taq酶抑制剂；3.模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋白残留；4.提取制备模板时丢失过多；5.模板核酸变性不彻底。
解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。
酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因4.忘记添加Taq酶。
解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq酶同时使用
引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。
解决方案:1.选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过
低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。
解决方案：设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不同（由0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳Mg2+浓度。
反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。
靶序列变异：靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。
解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。
物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。
假阴性解决方案：1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为95℃ ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45℃ ，然后再逐次提高（以2℃ /次为宜）。3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。
4.基因文库与CDNA文库有何区别？
①基因文库包含该生物的全部遗传信息，包括基因组间隔序列。CDNA文库只反映着MRNA的分子结构，不含内含子
②基因文库以DNA片段为材料。CDNA文库以MRNA为材料
③基因文库大，不易构建，筛选较难，假阳性高。CDNA文库则相反。
5、PCR引物设计的原则有哪些？
引物与模板要紧密互补。引物与模板之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应。
①长度：15-30bp常用为20mei左右。②引物碱基：G+C含量一般为40%-60%为佳③两个引物之间不应发生互补，特别应避免形成“引物二聚体”，如果无法避免，其3`端互补不应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列。④引物内部避免形成次级机构，尤其发卡结构。⑤引物的延伸从3`端开始，3`端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能，3`末端最后1个碱基最好是G或C。⑥引物的5`端限定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。⑦引物3`端不要终止于编码区域密码子的第3位，因密码子的第3为易发生简并会影响扩增特异性与效率。
1、什么是简并引物？设计简并引物时怎样降低简并度？
简并引物：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以由多个可能的编码序列，称之为简并序列。相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为。
简并度与选取氨基酸序列的长度和这一序列氨基酸对应密码子的多寡相关。①优先选取对应密码子较少的残基，②选取氨基酸序列的长度一般为5个，对应一段15个碱基的核苷酸序列。③放弃最后一个氨基酸放弃其密码子的第3位碱基，因此合成14个碱基的简并性引物，可降低简并度。
4、目前利用基因差异表达获得目的基因的技术主要有哪些？技术原理是什么？它们各有什么优点和缺点？
答：⑴差异显示PCR：根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA
优点：速度快，操作简单，灵敏度高而且样品需要量少，一定程度上克服了差减杂交和扣除杂技技术的不足。
缺点：假阳性率高，获得的cDNA片段很短，且其3`末端含有非翻译区，使基因分类或功能预测的难度增大。
⑵cDNA代表性差异分析
优点：假阳性低、特异性强、灵敏度高和重复性好缺点：操作复杂、实验周期长以及费用高⑶抑制性消减杂交
优点：假阳性率低、灵敏度高、表达效率高、操作简便。缺点：只能用于两组样品对照处理，不能提供基因表达数量上的差异。
⑷RNA任意引物PCR
原理：先从样本中提取总RNA，用随机引物合成cDNA的第一链，再用同样或者不同的引物
进行PCR合成第二链，凝胶电泳可以显示全部的PCR产物，再从中回收差异表达的基因片段，进行克隆、测序。
优点：有利于处理较短的cDNA片段。缺点：假阳性率较高
限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
限制-修饰系统：是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA 侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。同尾酶：是来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。
酶的星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性的现象。
3、DNA连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何利用价值？
作用特点：①不能连接两条单链DNA或环化DNA，只能连接双链DNA分子的单链缺口。②只能连接失去一个磷酸二酯键形成的单链断裂，不能连接缺失一个或多个氨基酸缺口③只作用于3端羟基和5端磷酸的链④连接反应需要ATP或NAD+和Mg2+
利用价值：可对缺口DNA，平末端DNA，黏性末端DNA进行连接。
4、为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，其主要用途是什么？
答：⑴反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶。反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA第二条链。
⑵用途：①以mRNA为模板合成其互补DNA，用于构建cDNA文库和基因克隆；②对具5′端突出的DNA片段的3′端进行补平和标记，制备杂交探针；③代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。
绪论 1.理论上的三大发现： （1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。 1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。 2.技术上的三大发现: （1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ） （2）DNA连接酶的发现（1967Gellert） （3）基因工程载体的发现 3.基因工程研究的内容： (1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 (2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。 (4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。 (5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析； (7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 第二章基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶 1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制 修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。 2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型 3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统 4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。 二、切割类型： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 三、产生的末端特征： 1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。） 2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。 3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。 四．影响核酸内切限制酶活性的因素： (1) DNA的纯度。 提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 (2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。 (4) DNA的分子结构 (5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=7．4时，最佳 1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。 二．DNA连接酶 1、种类： ①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子 2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子 3，一条链带有切口的DNA分子 4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。 ②、大肠杆菌DNA连接酶 1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子 2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段 3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段 4.底物要求严格，假阳性背景底
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
高中生物选修三基因工程知识点 基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同：
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2^n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验：1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA （噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA利叶绿体DNA,有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提 DNAo 7、DNA的分离抽提法：酚■氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 口、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的 OD260/OD280值应为1.7-2.0, OD260/OD230值应大于2.0,如果OD260/OD280小于1.7,可能有蛋白质污染，如果OD260/OD280大于2.0
或OD260/OD23O小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。 12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 基因工程屮最常用的工具酶 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指II类酶而言，限制性核酸内切酶的命名： 属名+种名。例如：Bacillus amylolique faciens H、Haemophilus influenzae d Bam H> Hind I o“属种株序” 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制一修饰系统。 16、限制性内切核酸酶的作用机制识别双链DNA中特定的核昔酸 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
一名词解释： 1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或的遗传信息。从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸()序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。 2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。 3 ：熔点温度或者解链温度，是变性进行到一半时的温度 4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。此种酶切割位点可同可不同。 5 技术：是一种在体外快速扩增特定基因或序列的方法，即聚合酶链式反应技术。（已知的短片段1以内） 6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。 7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链的一段序列 8杂种位点：：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 9基因表达：基因通过的转录和的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或转录本)的过程。 10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。 11 ：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。 起始密码子：终止密码子： 12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的分子群体、细胞群体或个体群体的过程。 13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 14同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 二选择题： 1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（聚合酶( )、硫酸化酶( ).荧光素酶(1)和三磷酸腺苷双磷酸酶()4种酶都有） 2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选； 3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签； 4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）； 5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。 三简答题： 1简要勾勒一副原核表达载体图。（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖
细菌的限制—修饰作用 核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。 星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。 同位酶：识别位点相同，但切点不同。 同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku （2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku
p35页表2-4 简述DNA连接酶的作用机制及其特点 说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤 基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等 质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。 共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（oc构型）线形DNA （L构型） 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 理想质粒载体的必备条件： A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因 D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围蓝白班筛选原理 穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因 黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体 噬菌体载体的优越性p69
一 1.载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2.基因工程学科建立的理论和技术发明 1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码 2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现 3.质粒的特点 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。 自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性 4.描述PBR322质粒筛选过程 PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。 若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则 1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落 2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素 上长的转化子即为重组子。 5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程 PUC是在PBR322质粒上改造的 若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则 将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。 6.基因工程操作的基本流程 1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA 2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基 因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子 3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其 整合到受体细胞的基因组中 4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞 5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达 7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要 1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充 2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因 3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索 8.蓝白斑筛选 是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色
专题1 基因工程 知识体系构建 专题整合 一、基因工程的基本工具 A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体 B.为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达 二、基因工程的操作程序 1.目的基因的获取 （1）目的基因：指编码蛋白质的结构基因。 （2）获取方法：从基因文库获取，原核基因也可直接分离获得；真核基因主要是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：启动子＋目的基因＋标记基因＋终止子。 ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 3.将目的基因导入受体细胞
A.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因与载体结合→目的基因的检测与鉴定 B.目的基因的检测与鉴定→提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞 C.提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 D.目的基因与载体结合→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 三、蛋白质工程 1.蛋白质工程流程 2.蛋白质工程与基因工程的区别：蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程；基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 训练3 利用蛋白质工程改造天然蛋白质，进而改变其功能，可获得毒副作用减小，专一性、药效和稳定性都增强的理想的药物。如胰岛素是治疗依赖型糖尿病的特效药物，但是天然胰岛素在人体内寿命只有几小时，重症病人每天得注射好几次药物，给病人增加了不便和痛苦。通过蛋白质工程改变胰岛素的空间结构，以延长胰岛素的半衰期，得到长效胰岛素；还可以在不改变胰岛素活性部位结构的前提下，增强其他部位结合强度，使之难以被酶破坏，从而增强其稳定性。 （1）若要批量生产以上提到的长效胰岛素，根据所学知识，需要用到哪些生物工程（ ）
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
名词解释 1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、 构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5’端相同。是PCR的起始点。 6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制 序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中进行繁殖的工具。 8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经 进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而 形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过 这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为 单克隆抗体。 15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和 重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16.改形抗体改性抗体（reshaped antibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 （V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的 宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimeric antibody）。 18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区 的整体空间构象。 19.单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链 可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲
思考题 第二章分子克隆工具酶 1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。 常用的工具酶 硝基序列内部进庁切割 DrU逵接癖 DT?A 1 i HaSe 将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢 DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通?u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ???板. 从3'方向令咸新生的互补谜 专一懺降解RMA 内切械肢晦.4?M4tl?或双1?DNA 2?说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)
基因工程细胞工程知识点汇总 一、基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 技术扩增目的基因
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：