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1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。
增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
7、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.8、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
一、单选1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。
2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。
3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。
4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。
5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。
6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。
7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。
8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。
9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。
10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。
11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。
12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
13、14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。
例如：B acillus am ylolique faciens H、H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。
17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
18、承载外源DNA的大小排序：质粒（<20kb）<噬菌体（20-30kb）<cosmid载体（40-50kb）<人工染色体载体（100-1000kb）。
专题一基因工程一【高考目标定位】1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。
2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。
二【课时安排】2课时三【考纲知识梳理】第1节DNA重组技术的基本工具教材梳理：知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
注意：对本概念应从以下几个方面理解：知识点二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
（2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。
②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”（1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体（2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
注意：比较有关的DNA酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。
注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
1. 基因工程概念：基因工程是一门以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代技术方法为手段的新兴交叉学科，它诞生于1973年，其发展十分迅速，新知识、新概念、新技术不断涌现，并广泛渗透到生命科学的各个领域，带动了整个生命科学的发展，是现代生物技术中的核心技术。
它为人类创造新生物开辟了新天地。
2. 基因工程的定义：基因工程是将不同来源的基因（DNA分子），按照工程学的方法进行设计，在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。
基因工程又称DNA重组技术。
3. 基因工程的特点及实施条件：基因工程的最大特点是分子水平上的操作，细胞水平上的表达。
其实施包括四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。
4. 基因工程的基本步骤：（1）分离制取带有目的基因的DNA片段；（2）DNA片段和载体DNA 在体外连接；（3）将重组DNA分子导入合适的受体细胞，并扩增繁殖；（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的重组体克隆；（5）外源基因的表达和产物的分离纯化。
5. DNA复制的特点：（1）DNA的复制是从特定的复制起始点开始并按5’-3’的方向进行；（2）DNA 分子的半保留复制；（3）DNA分子的半不连续复制；（4）DNA分子复制是通过DNA聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子的协同有序的工作完成的；（5）DNA分子复制具有高度的精确性和准确性。
6. DNA的变性、复性与杂交：在高温、强碱及某些试剂存在的条件下，双链DNA分子氢键断裂，两条链完全分离，形成单链DNA分子，这种情况称为DNA变性。
DNA的复性是指变性DNA在适当的条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的逆转过程。
热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。
杂交的基本原理是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程重点考点归纳1. 简述基因工程中的四大要素。
答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。
2. 简述基因工程诞生的基础。
答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。
1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。
1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA 连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。
理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。
第二章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。
2.II型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。
动物基因工程名词解释：1、体细胞克隆：以体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等) 为受体，将目的基因以DNA 转染的方式导入能进展传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进展动物克隆。
2、显微注射：：在显微操作仪下，将DNA用微吸管注射到处于原核时期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程过DNA复制而整合到基因组，然后将转化后的胚胎移植到受体子宫中继续发育，得到转基因动物。
3、ES细胞：4、基因打靶：是指外源DNA通过与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组, 整合到预定位点, 从而改变细胞遗传特性的方法。
5、基因敲除：将一个结构但功能不祥的基因去除，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除表达机制，从而推测该基因的生物学功能。
6、乳腺生物反响器：通过转基因技术将外源基因在动物乳腺中高效表达，在乳汁中生产目的产品。
问题：1、常用动物转基因的方法有哪些？比拟优缺点显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶法、精子载体法体、细胞核移植法、磷酸钙共沉淀法。
其中，常用动物转基因的方法有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞介导法。
〔1〕显微注射法的优点：操作技术性很强显微注射法的缺点：设备昂贵，胚胎死亡率高〔2〕逆转录病毒法的优点：操作简便，可大量感染细胞，形成单拷贝，转化率高逆转录病毒法的缺点：没有包装蛋白，不能形成完整的病毒颗粒2、谈谈如何获得转基因小鼠？显微注射法：书118页逆转录病毒法：书123页胚胎干细胞法：书123页3、转基因动物有哪些重要的应用？〔书138-143页〕〔1〕研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的在本质〔2〕建立多种疾病的动物模型，研究发病机理与治疗方法〔3〕改善动物生产性能，提高动物育种效率〔4〕作为医用或食用蛋白的生物反响器，可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。
4、比拟在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？动物：优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎一样且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上缺点：A、哺乳动物细胞的表达水平低B、高表达细胞株构建复杂C、细胞大规模培养工艺复杂D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的本钱较高第三章基因工程常规技术一、名词解释1．klenow fragment：DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5’ → 3’聚合酶活性和3’ → 5’外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。
可编辑修改精选全文完整版基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”2、DNA连接酶-----“分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车”1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。
（2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
（3）切割部位：磷酸二酯键（4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（5）识别序列的特点：（6）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA 连接酶（1）作用：将限制酶切割下来的DNA 片段拼接成DNA 分子。
（2）类型相同点：都连接磷酸二酯键3．“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA 片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制种类 E ·coli DNA 连接酶 T 4DNA 连接酶 来源 大肠杆菌 T 4噬菌体 功能特性只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来 缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低能力的双链环状DNA分子。
(3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
基因工程期末考试重点知识整理基因工程第一章基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。
分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。
真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。
平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。
同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。
如： BamHI 和BstI均可识别GGATCC。
同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。
如： TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。
DNA物理图谱：（多为质粒图谱）7、大肠杆菌中甲基化酶的种类①Dam甲基化酶，在序列GATC中A的N6位置引入甲基。
②Dcm甲基化酶，dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。
dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。
③Eco KI甲基化酶；④Sss I甲基化酶8、依赖于甲基化的限制系统（McrA,McrBC,Mrr）依赖于甲基化的内切酶E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统①mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。
mcr A基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。
②mcrB, C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。
一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC 具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA 中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。
③mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。
另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。
9、几个基本概念DNA聚合酶，以单链DNA为复制模板，由5'端开始复制到3'端的酶。
催化DNA的合成（具备模板、引物、dNTP等）及其相辅的活性。
反转录酶，依赖于RNA的DNA聚合酶,有5’-3’合成DNA活性,无3’-5’外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯键，剪断mRNA，cDNA第二条链合成）。
来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)RNA聚合酶，识别DNA中启动子特异序列，合成RNA，无需引物。
连接酶①T4 DNA连接酶，反应底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA②大肠杆菌DNA连接酶，活性与T4连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的参与，与平末端连接效率很低，不连接RNA。
③Taq DNA连接酶，可连接dsDNA中的缺口间的两个寡核苷酸，需NAD+的参与，最适反应温度45-65℃。
（VS TaqDNA聚合酶）④T4 RNA连接酶，可使单链DNA或RNA之间相互连接，可用于标记RNA的3’末端，单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。
T4多核苷酸激酶& 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶可将ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’末端。
主要用于对缺乏5’磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。
（探针）碱性磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5’磷酸的反应，可防止DNA片段自连。
第三章分子克隆载体10、分子克隆载体必须具备的元件①在克隆载体DNA分子合适的位置应有1至多个克隆位点（MCS），供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子②克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中能自我复制，或整合到DNA上随染色体DNA的复制而同步复制③克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因④克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。
11、表达载体必须具备的元件克隆载体必备元件+启动子，终止子，核糖体结合位点RBS书本p86-8712、标记基因的种类及作用原理选择标记基因：①氨苄青霉素抗性基因（ampr）作用机理：Ampicillin可以抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，即抑制细胞壁肽聚糖的合成。
ampr编码一种可分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。
(目的菌落周围出现散点菌落，即次生菌落，通过提高氨苄青霉素的浓度和控制培养时间≤12h减少次生菌落)②四环素抗性基因（tetr）作用机理：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位过程。
tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
③氯霉素抗性基因（Cmr）作用机理：氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。
常用的cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，即一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在时，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。
④卡那霉素（新霉素）抗性基因作用机理：卡那霉素和新霉素是氨基糖苷类抗生素，都可与核糖体结合并抑制蛋白质的合成。
该基因（kanr/neor）是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。
琥珀突变抑制基因supF 琥珀突变（书本p41）筛选标记基因：α -互补（蓝白斑筛选）：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶的-α肽基因（lacZ’）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。
这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为~。
插入失活，某段DNA序列的插入，使得被插入的基因功能丧失功能，从而达到筛选的目的。
蓝白斑筛选：在lacZ’编码区上游插入一小段DNA片段，不影响β-半乳糖苷酶的功能互补。
但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将不可避免的产生无α互补能力的β-半乳糖苷酶片段13、λDNA的特点λDNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端（cohesive end），且两者互补。
进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。
14、λ载体的选择标记lacZ基因，在填充片段中带有β-半乳糖苷酶基因片段cI基因失活cI基因：全面抑制并阻断裂解生长必须基因的表达，促进λ-噬菌体进入溶原状态。
外源基因插入cI基因中，使E.coli进入裂解生长状态。
Spi筛选野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。
Spi+ :λ噬菌体不能感染E.coli（P2）Spi- :λ(red- gam-）噬菌体能感染E.coli（P2）形成小噬斑宿主：recA+ ；chi位点第四章人工染色体载体15、人工染色体的种类和必备元件（概念PPT，结构，组成，筛选）酵母人工染色体载体YAC、细菌人工染色体载体、P1载体和PAC载体YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。
它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分：一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS）；一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中将chr.载体均匀的分配到子细胞中）；一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定；选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因）；克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。
第五章表达载体16、表达载体启动子的种类Plac 启动子（诱导型启动子）、Ptac 启动子（诱导型启动子）、T7启动子（T7噬菌体）和PL启动子（λ噬菌体）17、T7启动子的工作原理（参见PPT图文）第六章基因操作中大分子的分离和分析18、质粒DNA的提取原理及步骤（实验）碱裂解法提取质粒DNA原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
