细菌脂多糖的制备与纯化

细菌脂多糖的提取与制备生技052 张创峰指导教师宫强摘要目的：提取制备出鸡白痢细菌的脂多糖（Lipopolysaccharides LPS），并检测出其纯度，免疫动物后检测其诱导机体产生抗体的效价。

方法：对刚接种的细菌进行37℃培养过夜，此时菌体大致处于对数期。

利用热酚水法提取LPS，通过离心、反复冻融对菌体进行破碎，再透析、浓缩进行LPS粗提取，进而通过酶解、加丙酮沉淀等一系列步骤纯化LPS；然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对制备的LPS溶液中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，配制成适合注射的LPS浓度；最后通过皮下注射免疫鸡，对鸡血进行离心得到血清，保存血清。

免疫三次，采血三次，利用间接Elisa法测定抗体的效价。

结果：成功提取了细菌的LPS，免疫注射浓度为121.5μg/mL。

未经酶解的粗制LPS于260nm处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS，于260nm处吸收值较小。

经分光光度计测定，结果为0.324，从标准曲线找出其蛋白含量为0.59mg/mL。

然而所提取的LPS并未使动物产生抗体，免疫动物不成功。

关键词：鸡白痢细菌，脂多糖（LPS），提取，糖含量，免疫，ELISAExtraction and Preparation of SalmonellaLipopolysaccharideGrade 2005, Class2, Major of Biotechnology Chuagfeng ZhangTutor Qiang GongABSTRACTObjective This study was to extract and prepare Salmo nella pullorum’s Lipopolysaccharides(LPS), and test its purity, after immune the animals, we will detect its antibody titer induced by the production.Methods Put the vaccinated Salmonella at just 37℃ overnight train, to ensure the biomass is at logarithmic phase, and then extraction of LPS from biomass with mixture of hot phenol-water, through centrifugation and repeated freezing and thawing the biomass to carry out broken the biomass, and then dialysis, dialysis the solution for the crude LPS extraction, through the zymohydrolysis, adding acetone to precipitate LPS, using the ultraviolet spectroscopy, the BSA standard curve method and anthrone-sulfuric acid method for testing the content of nucleic acids, protein, sugar of the prepared LPS solution. Finally, through the subcutaneous injection to immune chicken, to obtain serum from centrifuged blood, preservation serum, immunization three times, blood three times, select chicken serum antibodies, using an indirect ELISA method to detect the titer of antibody.Results We successfully extracted LPS from the Salmonella, the concentration for immunization is 121.5μg/mL. Without the enzyme in the crude LPS there is strong absorption of 260nm by the enzyme to deal with separation and purification of LPS, in a relatively there is small absorption of 260nm Department. Measured by the spectrophotometer, the results is 0.324, we can find out the protein content is 0.59mg/mL from the standard curve. Nevertheless, the extraction of LPS did not make animals generate antibodies, the immune on animals is unsuccessful.KEY WORDS: Salmonella Pullorum, Lipopolysaccharides(LPS), extracts, sugar content, immunization, ELISA目录前言 (1)第1章文献综述 (2)1.1 鸡白痢简介 (2)1.1.1 病原 (2)1.1.2 传播流行特点 (2)1.1.3 病理变化 (2)1.1.4 检测手段 (3)1.1.5 研究趋势 (4)1.2 LPS研究进展 (5)1.2.1 LPS的来源 (6)1.2.2 LPS的结构 (6)1.2.3 LPS提取方法的研究 (6)第2章实验材料与方法 (8)2.1实验材料 (8)2.1.1菌株与实验动物 (8)2.1.2 试剂 (8)2.1.3 主要溶液的配制 (8)2.1.4 主要仪器 (10)2.2 实验方法 (10)2.2.1培养基的配制 (10)2.2.2菌体的获得 (11)2.2.3 LPS粗品的制备 (11)2.2.4 LPS的纯化 (12)2.2.5 LPS某些物质含量的测定 (12)2.2.6 O-SP制备 (13)2.2.7 免疫与采血 (13)2.2.8 血清分离 (13)2.2.9抗体效价的测定 (13)第3章结果与讨论 (15)3.1 结果 (15)3.1.1 LPS核酸的检测 (15)3.1.2 LPS蛋白含量测定 (15)3.1.3 LPS糖含量测定 (15)3.1.4提取的LPS免疫原性检测 (16)3.2 讨论 (17)第4章结论 (19)参考文献 (20)致谢 (22)外文资料译文前言禽细菌病(Salmonellosisavium)，即鸡白痢，是一个概括性术语，指由细菌属中的任何一个或多个成员所引起禽类的一大群急性或慢性疾病。

细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。

在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。

鸡白痢是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。

本病特征为幼雏感染后常呈急性败血症，发病率和死亡率都高，成年鸡感染后，多呈慢性或隐性带菌，可随粪便排出，因卵巢带菌，严重影响孵化率和雏鸡成活率。

本病可经蛋垂直传播，也可水平传播。

目前，预防鸡白痢普遍采用庆大霉素、痢特灵、氯霉素以及新型喹诺酮类药物，但是，用药物预防需要防止长时间使用一种药物，更不更一味加大药物剂量达到防治目的。

而且需要有效药物在一定时间内交替、轮换使用，药物剂量要合理。

做到这些对于一般的养殖来说是比较困难的。

而生物制剂在防治鸡白痢疾病方面有较好效果，具有安全、无毒、不产生副作用，细菌不产生抗药性，价廉等特点。

经大批量的实验认为，生物制剂防治鸡白痢病的效果多数情况下相当或优于药物预防的水平。

因此，研发预防鸡白痢的新型疫苗势在必行。

而LPS是鸡白痢细菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。

各项研究的进行以及方法的研究都需要对鸡白痢细菌LPS结构特性及其特异性免疫保护进行研究，因而提取细菌LPS是各项相关工作的第一步，细菌LPS本身目前已成为医学和免疫学的研究热点之一。

因此提取与制备细菌LPS更加必要的。

本文直接通过提取鸡白痢细菌LPS制备抗原，对鸡进行免疫，对于研究预防鸡白痢疾病的疫苗也是有其现实意义的。

本文研究了热酚水法提取脂多糖，通过离心、反复冻融，透析、浓缩、酶解一系列步骤进行纯化，然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对LPS中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，最后通过皮下注射免疫兔子，从兔子血清中获得抗体，利用间接Elisa法测定抗体的效价。

第1章文献综述1.1 鸡白痢简介鸡白痢(Salmonellosisavium)是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。

是一种古老而且危害严重的禽类传染病，在世界范围内均有发生，是世界性疾病。

细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。

在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。

在所有动物中，最常报道的细菌来源于家禽和禽产品。

因此鸡白痢已成为严重影响家禽养殖业的问题之一。

1.1.1 病原鸡白痢是由鸡白痢细菌所引起鸡的一大群急性或慢性疾病。

鸡白痢细菌具有高度宿主适应性。

本菌为两端稍圆的细长杆菌（0.3～0.5um×1～2.5um），对一般碱性苯胺染料着色良好，革兰氏阴性。

细菌常单个存在，很少见到两菌以上的长链。

在涂片中偶尔可见到丝状和大型细菌。

本菌不能运动，不液化明胶，不产生色素，无芽胞，无荚膜，兼性厌氧。

分离培养时应尽量避免使用选择性培养基，因为某些菌株特别敏感。

细菌在下列培养基中生长良好，如营养肉汤或琼脂平板。

在普通琼脂、麦康凯培养基上生长，形成圆形、光滑、无色呈半透明、露珠样的小菌落[1]。

在外界环境中有一定的抵抗力，常用消毒药可将其杀死。

1.1.2 传播流行特点各种品种的鸡对本病均有易感性，以2～3周龄以内雏鸡的发病率与病死率为最高，呈流行性。

随着日龄的增加，鸡的抵抗力也增强。

成年鸡感染常呈慢性或隐性经过。

火鸡对本病有易感性，但次于鸡。

鸭、雏鹅、珠鸡、野鸡、鹌鹑、麻雀、欧洲莺和鸽也有自然发病的报告。

芙蓉鸟、红鸠、金丝雀和乌鸦则无易感性。

一向存在本病的鸡场，雏鸡的发病率在20％～40％左右，但新传入发病的鸡场，其发病率显著增高，甚至有时高达100％，病死率也比老疫场高。