细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究

３０　中１３友好医院学报２０１３年第２７卷第１期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｉｎａ－Ｊａｐｃｍ　Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，２０１３　Ｆｅｂ，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．Ｊ　

细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究　

赵为公，王　莹，邱希江，白　斌，邱裕生　（西安交通大学第一附属医院骨科，陕西西安７１００６１）　

摘要　目的：寻找调节破骨细胞分化成熟的途径。方法：采用细胞核因子一ＫＢ受体活化因子配体（ＲＡＮＫＬ）和巨　噬细胞集落刺激因子（Ｍ—ＣＳＦ）体外诱导骨髓单核细胞分化为成熟破骨细胞的培养方法，在培养体系中加入不　同浓度细菌脂多糖（ＬＰＳ），用抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色观察成熟破骨细胞形成情况；实时定量ＲＴ—ＰＣＲ　检测ＩＪＰＳ处理后破骨细胞前体表达核因子一ＫＢ受体活化因子（ＲＡＮＫ）和Ｍ—ＣＳＦ受体ｍＲＮＡ。结果：ＬＰＳ不能刺　激骨髓单核细胞形成ＴＲＡＰ阳性的破骨细胞；减少了ＲＡＮＫＬ诱导的ＴＲＡＰ阳性破骨细胞形成数量；Ｏ．２ｎｇ／ｍｌ　和２０ｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ降低了３０％和９０％ＲＡＮＫＬ诱导ＴＲＡＰ阳性细胞形成数量（与未加ＩＪＰＳ组比较，均Ｐ＜Ｏ．０１）；降　低破骨细胞前体表达ＲＡＮＫ和Ｍ—ＣＳＦＲ　ｍＲＮＡ。结论：ＬＰＳ能够抑制ＲＡＮＫＬ诱导的破骨细胞分化成熟，抑制　破骨细胞前体表达ＲＡＮＫ和Ｍ—ＣＳＦＲ，能够阻断其向成熟分化。　关键词：破骨细胞；细菌脂多糖；核因子一ＫＢ受体活化因子；巨噬细胞集落刺激因子受体　中图分类号：Ｒ３９２．１２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—００２５（２０１３）０１—００３０—０４　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—００２５．２０１３．０１．００８　

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｅｈａｒｉｄｅ／／ＺＨＡＯ　Ｗｅｉ－ｇｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙｉｎｇ，ＱＩＵ　Ｘｉ—　ｊｉａｎｇ，ｅｔ　ａｌ／／Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，２０１３　Ｆｅｂ，２７（１）：３０－３３　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｏｓ—　ｔｅｏｃｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）ａｎｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ（Ｍ—ＣＳＦ）ｆｒｏｍ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｔａｒｔｒａｔｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓ－　ｐｈａｔａｓｃ　（ＴＲＡＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　０ｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬＰＳ．ＲＴ－ＰＣＲ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ＲＡＮＫ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，Ｍ－ＣＳＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＬＰＳ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｄｕｃｅ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　３０％ＴＲＡＰ（＋）ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ（Ｐ＜０．０１）ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　０．２ｎｇ／ｍｌ　ａｎｄ　９０％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０１）ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　２０ｎｇ／ｍ１．ＬＰＳ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ（ＲＡＮＫ）ａｎｄ　Ｍ—ＣＳＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＬＰＳ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ＲＡＮＫＬ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｓｔｅ０ｃｌａｓｔ０ｇｅｎｅｓｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＮＫ　ａｎｄ　Ｍ—ＣＳＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ；１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ；ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔ—　ｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｕｔｈｏｒ’Ｓ　ａｄｄｒｅｓｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６１，Ｃｈｉｎａ　

破骨细胞起源于骨髓单核巨噬细胞系。骨髓　成骨细胞／基质细胞分泌核因子一ＫＢ受体活化因　

子配体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ　ｌｉｇ．　

ａｎｄ．ＲＡＮＫＬ）结合破骨前体细胞表面核因子一ＫＢ　

受体活化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—　

ＫＢ，ＲＡＮＫ）。促使破骨前体细胞发育成抗酒石酸　

酸性磷酸酶（ｔａｒｔｒａｔｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　ＴＲＡＰ）阳性和表达降钙素受体的成熟多核破骨细　

作者简介：赵为公（１９６７一），男，副主任医师，医学博士。　收稿日期：２０１２—１０—２４　修回日期：２０１２一ｌ１—２６　胞，执行骨吸收功能。目前认为ＲＡＮＫＬ—ＲＡＮＫ相　

互作用是维持正常破骨细胞分化、增殖和存活所　

必需的［１－３】　许多细胞因子在破骨细胞发育的不同　

阶段参与了破骨细胞的分化过程。巨噬细胞集落　

刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，　Ｍ—ＣＳＦ）基因敲除小鼠，表现为缺少成熟的破骨细　

胞而患有骨硬化症　；研究显示Ｍ—ＣＳＦ与破骨细　

胞前体的Ｍ—ＣＳＦ受体结合对破骨细胞活化及骨　

重建耦联过程发挥调节作用ｆ５Ｉ６１。细菌细胞壁成分　

如细菌脂多糖（１ｉｐ叩０ｌ

ｙｓａｅｃｈ　ｄｅ，ＬＰＳ）通过骨髓　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，２０１３　Ｆｅｂ，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．Ｊ中日友好医院学报２０１３年第２７卷第１期　３１　

基质或成骨细胞影响破骨细胞活性　］，但ＬＰＳ是　

否直接调节破骨细胞向成熟分化目前尚不清楚。　

我们建立了小鼠骨髓单核细胞在ＲＡＮＫＬ和Ｍ—　ＣＳＦ作用下诱导分化为成熟破骨细胞的体外培养　

系统．利用ＬＰＳ处理ＲＡＮＫＬ诱导的破骨细胞，发　

现破骨细胞前体减少ＲＡＮＫ和Ｍ—ＣＳＦ受体ｍＲ．　

ＮＡ的表达，可抑制其向成熟分化，这些结果对骨　不连、骨延迟愈合和骨质疏松等疾病提供基础实　

验支持。　

１材料和方法　

１．１实验动物　

７－９周龄雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（ｎ＝２０）由西安交　通大学医学院实验动物中心提供。　１．２主要试剂　胎牛血清（ＦＢＳ）和ＯＬ—ＭＥＭ培养基购于美国　

Ｇｉｂｃｏ公司：小鼠ＲＡＮＫＬ和Ｍ—ＣＳＦ购于美国　

Ｒ＆Ｄ公司：ＬＰＳ和ＴＲＡＰ染色试剂盒（Ｃａｔ　Ｎｏ：　

３８７一Ａ）购于美国Ｓｉｇｍａ公司；ｃＤＮＡ逆转录和　

ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ实时定量ＰＣＲ试剂盒购于美国　

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。　１．３体外诱导破骨细胞的形成　

将７￣９周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠乙醚麻醉下断颈处　死．无菌条件下取四肢长骨，剪断长骨两端，　

Ｈａｎｋｓ液冲洗骨髓腔，用淋巴细胞分离液在室温　

下２０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ获得骨髓单核细胞。１．３ｘ　

１０ｓ小鼠骨髓单核细胞接种于每孔含０．２ｍｌ完全　

培养基（１０％ＦＢＳ，１００ＩＵ／ｍｌ青霉素和０．１ｍｇ／ｍｌ链　

霉素的仅一ＭＥＭ）的９６孔培养板中，采用３０ｎｇ／ｍｌ　

Ｍ—ＣＳＦ、５ｎｇ／ｍｌ　ＲＡＮＫＬ和０．２～２０ｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ处理　骨髓单核细胞。每组接种３孔，在３７℃含５％ＣＯ　

湿化空气的培养箱培养１０２ｈ。收集细胞，进行　ＴＲＡＰ染色。光镜下观察到含２个胞核以上且呈　ＴＲＡＰ染色阳性的多核巨细胞即为破骨细胞，其　

计数在２００倍光镜下进行，每组玻片任选５个视　

野，计数阳性细胞均值。　１．４亚甲蓝摄取实验　

无水乙醇固定细胞５ｍｉｎ，用０．１Ｍ的Ｂｏｒａｔｅ　

缓冲液（ｐＨ　８．５）洗细胞１次。加入ｌ％亚甲蓝染液　

染色３０ｍｉｎ，用Ｄｙｎａｔｅｃｈｙ读取ＯＤ值。　１．５实时定量ＲＴ—ＰＣＲ　

加入ｌｍｌ　Ｔｒｉｚｏｌ溶液裂解１ｘｌＯ　细胞。经氯　

仿、异丙醇提取细胞总ＲＮＡ，乙醇洗涤，ＤＥＰＣ水　溶解。将提取的ＲＮＡ逆转录。Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ—ＰＣＲ：选　

择１３一ａｃｔｉｎ作为内参，根据Ｂ—ａｃｔｉｎ、ＲＡＮＫ和Ｍ—　ＣＳＦ受体基因序列设计引物，由北京三博远志生　

物技术有限责任公司合成。１３一ａｃｔｉｎ：Ｆｏｒｗａｒｄ：５’一　

ＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ　一３’：Ｒｅ—　

ｖｅｒｓｅ：５’一ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡ—ＧＴＣＣＧ一　３’；Ｍ—ＣＳＦ受体：Ｆｏｒｗａｒｄ：５’一ＡＡＣＡＡＧＴＦＣＴＡ—　

ＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧ一３’；Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’一ＧＡＡＧＣ．　

ＣＴＧＴＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＴＧＴＣ　一３’：ＲＡＮＫ：Ｆｏｒ—　

ｗａｒｄ：５一ＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣ一３，Ｒｅｖｅｒｓｅ：　５一ＴＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣ　丌ＣＴ一３。扩增反应条件：　

９５℃１０ｓ预变性；９５　５ｓ，６０ｑＣ　１５ｓ，７２℃１０ｓ，共　

４Ｏ个循环。每份标本做复孔。分析ＲＡＮＫ和Ｍ—　ＣＳＦ受体ｍＲＮＡ的相对表达量［９１。　

１．６统计学方法　

应用ＳＰＳＳ１５．０统计软件对结果进行分析，两　

样本参数采用ｔ检验。　

２结果　２．１　ＬＰＳ不能刺激骨髓单核细胞分化为破骨细　

胞　

图１Ａ和ｌＢ示（见封二），小鼠骨髓单核细胞　与可溶性ＲＡＮＫＬ和Ｍ—ＣＳＦ共同孵育１０２ｈ后进　

行ＴＲＡＰ染色，显微镜下观察到大量多核ＴＲＡＰ　

阳性细胞。图１Ｃ示，ＬＰＳ在没有ＲＡＮＫＬ存在的　

情况下不能诱导骨髓单核细胞形成破骨细胞；但　图１Ｄ示．ＬＰＳ与ＲＡＮＫＬ、Ｍ—ＣＳＦ共同处理骨髓　

单核细胞１０２ｈ后，ＬＰＳ可以抑制ＲＡＮＫＬ诱导的　破骨细胞形成。　

２．２　ＬＰＳ抑制ＲＡＮＫＬ诱导的破骨细胞分化作用　

图２示，在ＲＡＮＫＬ诱导的ＴＲＡＰ阳性形成　时，加入０．２～２０ｎｇ／ｍｌ的和不加入ＬＰＳ比较，发现　

０．２ｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ可以降低３０％（Ｐ＜０．０１）ＲＡＮＫＬ诱导　

ＴＲＡＰ阳性细胞的数量：２０ｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ则可以降低　９０％（Ｐ＜０．０１）ＲＡＮＫＬ诱导ＴＲＡＰ阳性细胞的数