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细菌脂多糖诱导人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α 的合成及核因子κB 的活化

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・实验研究・[文章编号]　100723949(2002)1020420320204细菌脂多糖诱导人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α的合成及核因子2κB 的活化李凝旭,李建军,李庚山,王　晶,徐红新,李　夏,彭　俊(武汉大学人民医院心内科,湖北省武汉市430060)[主题词]　炎症;　肿瘤坏死因子;　单核细胞;　核因子2κB ;　免疫细胞化学[摘　要]　为研究细菌脂多糖对人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α合成和核因子2κB 活化的影响,采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,经细菌脂多糖刺激后,应用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子α水平随刺激剂量和时间的变化,应用免疫细胞化学方法观察核因子2κB 在单核细胞的激活随刺激时间的变化。

发现核因子2κB 在接受刺激15min ～1h 之间,随刺激时间的延长逐渐从胞质向胞核转移,1h 达高峰。

细菌脂多糖呈浓度依赖性(1～1000μg ΠL )诱导肿瘤坏死因子α合成,肿瘤坏死因子α在刺激后1h 出现,6h 达到高峰,其合成出现在核因子2κB 的活化后。

以上提示细菌脂多糖通过激活单核细胞内核因子2κB 来诱导炎性细胞因子肿瘤坏死因子α的合成。

[中图分类号]　R541.4[文献标识码]　ALipopolysaccharide I nduced Tumor N ecrosis F actor 2αSynthesis and Nuclear F actor K ap 2pa B Activation in H uman MonocytesLI Ning 2Xu ,LI Jian 2Jun ,LI Y u 2Shan ,W ANGJing ,X U H ong 2X in ,LI X ia ,and PE NGJun(Department o f Cardiology ,People Hospital o f Wuhan University ,Wuhan 430060,China )[MeSH ]　In flammation ;　Tum or Necrosis Factor ;　M onocytes ;　Nuclear Factor 2kappa B ;　Immunohistochemistry[ABSTRACT ] Aim T o evaluate the effect of lipopolysaccharide on human m onocytes tum or necrosis factorαproduction and nuclear factor kappa B activation. Methods M onocytes were is olated by Ficoll density gradient from blood of healthy v olun 2teers.　The am ount of tum or necrosis factor αprotein in culture medium was quantified by using tum or necrosis factor αE LIS A systems.　Nuclear factor kappa B translocation in m onocytes was observed by immunohistochemistry assay. R esults We find that nuclear factor kappa B was activated after being stimulated for 15minutes and reached peak at 1hour.　Lipopolysaccharide (1μg ΠL ～1mg ΠL )induced m onocytes tum or necrosis factor αproduction in a dose 2dependent manner.　Tum or necrosis factor αprotein in medium could be detected at 1hours ,and achieve peak at 6hour.　Nuclear factor kappa B activation before tum or ne 2crosis factor αproduction in m onocytes. Conclusions Lipopolysaccharide induced pro 2in flammation cytokine production at least in part through nuclear factor kappa B activation in m onocytes.[收稿日期]　2001211229 [修回日期]　2002206216[作者简介]　李凝旭,女,1977年出生,心血管内科硕士研究生,主要研究方向为冠心病。

李建军,男,1957年出生,博士后,主任医师,教授,博士生导师,主要研究方向为冠心病。

李庚山,男,1932年出生,主任医师,教授,博士生导师,主要研究方向为冠心病。

单核Π巨噬细胞是人体最主要的免疫Π炎性细胞,同时也是动脉粥样硬化斑块的重要组成成分。

核因子κB (nuclear factor kappa B ,NF 2κB )是一种重要的炎症转录因子,许多炎症基因的表达是通过NF 2κB 的活化来实现的。

本文以细菌脂多糖诱导人外周血单核细胞的炎症反应,并观察NF 2κB 在单核细胞炎症反应中的作用,以确立NF 2κB 的活化与单核细胞炎症反应的关系。

1　试剂与方法1.1　试剂细菌脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS )011B4(Sig 2ma ),肿瘤坏死因子α(tum or necrosis factor α,T NF 2α),E LIS A 试剂盒(G enzyme ),p65鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz ),RPMI1640(GI BC O ),淋巴细胞分离液(上海化学试剂二厂)。

1.2　外周血单核细胞的分离培养与鉴定采健康志愿者外周血,生理盐水1∶1稀释,用吸管轻铺于比重1.077淋巴细胞分离液表面,稀释血与淋巴细胞分离液体积约2∶1,形成清晰界面。

用水平或台式离心机1500r Πmin 离心25min ,离心后单个核细胞悬于分层液面,呈白膜状。

用吸管轻轻将单个核细胞吸入另一管内。

用生理盐水清洗2次(1500r Πmin ,7min )。

使用台式离心机,常带有少量红细胞,可用红细胞裂解液(150mm ol ΠL NH 4Cl ,10mm ol ΠL NaHC O 3,1mm ol ΠL Na 4E DT A )[1]去除。

将清洗后的细胞重悬于RPMI1640(含25mm ol ΠL HEPES ,1nm olΠL谷氨酰胺,1.0×105uΠL青霉素和链霉素),台盼蓝拒染实验示活细胞>95%。

将细胞接种于24孔培养板,每孔1m L,置于37℃、5%C O2培养箱培养1h后吸出培养基,用新鲜培养基用力清洗3次,将未贴附细胞洗脱,贴附细胞为单核细胞[2,3]。

用细胞刮片将细胞刮下,重悬于上述RPMI1640并调整细胞密度为1×109ΠL。

将粘附于盖玻片上的单核细胞用瑞氏染色鉴定,80%细胞为单核细胞,细胞核呈肾形及马蹄形,紫蓝色。

1.3　试验分组①不同浓度脂多糖(1、10、100和1000μgΠL)作用于人单核细胞6h对T NF2α浓度影响;②脂多糖(1mgΠL)作用人单核细胞不同时间(0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16和18h)对T NF2α浓度影响;③选取最佳浓度脂多糖(1mgΠL)作用人单核细胞不同时间(5、15、30、60和120min)对单核细胞中NF2κB激活的影响。

1.4　酶联免疫吸附测定培育后收集上清,按照试剂盒操作说明进行,主要步骤如下:将不同浓度的T NF2α标准品(2000、1 000、500、250、125、62.5和31.25ngΠL)及待测样品以每孔100μL加入酶标孔,室温下孵育120min,洗板4次。

加检测剂工作液,室温60min,洗板4次。

加底物显色剂避光室温30min,加终止液。

在450nm 波长下读取各孔吸光度值(OD值)。

以浓度值为横坐标,所测各标准OD值为纵坐标,绘制标准曲线。

利用各样本孔测得的OD均值,从标准曲线上查得相应的浓度值,以ngΠL表示。

每个待测值均作4个样本,每个样品及标准品各浓度均作复孔。

1.5　免疫细胞化学采用SP法,终止培养后,用生理盐水清洗2次,置于-20℃甲醇中固定10min,生理盐水洗一次。

用3%P BS稀释的H2O2室温30min,去除内源性过氧化物酶,P BS洗3次,羊血清37℃封闭30min,加一抗(1∶50)4℃过夜,P BS洗3次,加二抗37℃30 min,P BS洗3次,链酶卵白素辣根过氧化物酶37℃30min,P BS洗3次,DAB镜下显色。

每个测定值制4张片,每张片取200个细胞。

用全自动图像分析仪(Olym pas BX50显微摄影系统,P olaroid DMC1数码相机,联想奔月2000型计算机),采用HPI AS2000型图像分析软件测定平均光密度值(OD)、阳性反应面积(Ar)和阳性细胞率(Pr)。

1.6　统计处理数据采用均数±标准差(x±s)表示,用t检验判断均数差异显著性。

2　结果2.1　不同浓度的脂多糖对单核细胞合成肿瘤坏死因子α的影响如图1(Figure1)所示,在不同浓度脂多糖刺激下,单核细胞合成T NF2α随脂多糖浓度的增加而增加,其中以1mgΠL脂多糖刺激作用最强。

单核细胞T NF2α的合成对脂多糖的刺激呈剂量依赖性。

图1.　不同浓度细菌脂多糖作用于人单核细胞6h对肿瘤坏死因子α合成的影响(n=4).Figure1.　E ffects of different concentration of lipopolysac2 ch aride on tumor necrosis factor2αproduction in hum an mono2 cytes.2.2　脂多糖作用不同时间对肿瘤坏死因子α合成的影响如图2(Figure2)所示,单核细胞在脂多糖(1mgΠL)刺激后1h开始合成T NF2α,在6h内随刺激时间延长T NF2α合成增加,刺激6h时达到高峰,达峰值后,T NF2α合成呈缓慢下降趋势,但持续到18h仍保持较高浓度。

图2.　细菌脂多糖(1mgΠL)作用人单核细胞不同时间对肿瘤坏死因子α合成的影响(n=4).Figure2.　The time curve of hum an monocytes Tumor necro2 sis factor2αproduction induced by lipopolysacch aride(n=4).2.3　免疫细胞化学检测如图3(Figure 3)所示未受刺激的细胞核染色较蓝,核中无阳性染色;刺激5min 细胞染色情况与未受刺激的细胞无明显区别;刺激15min 细胞核周开始出现新月状阳性染色区域;刺激0.5h 胞核中阳性染色区域逐渐扩大;到1h 胞核中阳性染色达到高峰,可见整个胞核被阳性染色区覆盖,核蓝染受抑制,这种情况持续到2h 。

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多不饱和脂肪酸代谢及其对炎症的调节

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免疫佐剂的作用和发展

免疫佐剂的作用和发展

免疫佐剂的作用和发展佐剂（Adjuvants）是先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂或抗原佐剂。

佐剂可选择性地改变免疫应答的类型，产生体液和\或细胞免疫。

改变体液抗体的种类IgG亚类和抗体的亲和性。

佐剂可改变抗原的构型，使疫苗诱导T辅助细胞和细胞毒T淋巴细胞(CHL)反应。

佐剂可改变免疫反应为MHCⅠ型或MHC Ⅱ型。

佐剂还能改变T辅助细胞(Th1和Th2)的免疫反应。

随着生物技术的发展，新一代疫苗，如合成肽疫苗、基因工程疫苗等的研究已取得了初步成果，但现代疫苗研究过程所遇到的一个关键问题是其免疫原性较弱，往往需要佐剂来克服。

对适合于推广应用的新疫苗的研制，佐剂的研究显得至关重要。

因此，近年来免疫佐剂的研究进展更为迅速。

本文就各种免疫佐剂的研究现状和应用前景进行简要的讨论。

1 矿物质矿物质佐剂是传统佐剂中的一类，包括AL(OH)3和磷酸铝等。

1926年Glenny首先应用铝盐吸附白喉类毒素，至今已有70多年了，但它还是唯一被FDA批准用于人用疫苗的佐剂。

常用佐剂中效果较好的是AL(OH)3和磷酸铝佐剂，其次磷酸钙较常用。

铝佐剂主要诱导体液免疫应答,抗体以IgG1类为主,刺激产生Th2型反应，还可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平,也比较安全,对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。

它虽是人医和兽医均获批准的佐剂，广泛应用于兽医疫苗，特别是各种细菌苗，但其仍存在缺点：如有轻度局部反应，可以形成肉芽肿，极个别发生局部无菌性脓肿；铝胶疫苗怕冻；可能对神经系统有影响；不能明显地诱导细胞介导的免疫应答。

疫苗中加入磷酸三钙[Ca3(PO4)2]作佐剂，与铝胶一样具有吸附沉淀作用，但使用更加简便。

其缺点是：含盐量高；贮存日久有结晶沉淀。

皮下注射时偶有肿胀或结块,抗原免疫原性弱时,不足以提高其免疫原性,特别是保护性免疫机制要求活性介导的免疫参加时,应使用其他佐剂。