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人工诱导石斑鱼雌核发育的初步研究摘要：采用灭火的鞍带石斑鱼精子精子遗传物质进行完全灭活，灭活后的精子与斜带石斑鱼卵子相结合，获得单倍体受精卵，经冷休克加倍处理，得到雌核发育二倍体，实验结果显示：鞍带石斑鱼精子在紫外照射强度为160-240lux下，照射4min后能使精子完全灭活，处理水温4-6℃条件下，受精卵最佳处理时刻为受精后第6min，最佳冷休克持续时间为30min。
关键词：石斑鱼，雌核发育，人工诱导，紫外照射，冷休克鱼类雌核发育工作开始于20世纪50年代，淡水鱼类开展的较多[1]，海水鱼类这方面的研究相对比较落后，目前仅在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[2]、牙鲆(Paralichthys oliva-ceus)[3]、真鲷(Pagrosomusmajor)[4]、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)[5]欧鲈(Dicentrarchus labrax)[6]大黄鱼(Pseudosciaena crocea )[7]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[8]等有关的报道。
雌核发育研究作用主要体现在三个方面，一是在一些生长差异大的养殖鱼类中构建全雌鱼或者与性转化技术相结合构建功能性雌雄鱼，然后和正常鱼交配进而得到全雌或全雄鱼，二是人工诱导雌核发育可以快速建立纯系，对提高鱼的种质质量具有重要意义，三是雌核发育后代具有高度的纯合性，能够快速淘汰劣质基因，稳定杂种优势，提高选择效率，对鱼类育种和种质资源保护具有重要意义。
石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类,是中国南方沿海广东、海南、福建、广西等海水养殖的主要对象，经济价值巨大，中国石斑鱼类养殖和其他海水养殖鱼类是继海藻、贝类和虾类之后第四个海水养殖发展浪潮而兴起的[9]。
斜带石斑鱼石斑鱼在分类学上隶属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae）、石斑鱼属（Epinephalus），有关斜带石斑鱼或者石斑鱼雌核发育的报道国内外均未见报到，本研究采用紫外灭活精子，低温冷休克的方法系统深入的研究了斜带石斑鱼雌核发育的条件，以期为石斑鱼的研究提供基础资料，同时对石斑鱼养殖产业的发展以及种质资源保护提供科学依据。
鱼类卵细胞的发育与成熟1.卵原细胞反复进行有丝分裂，细胞数目不断增加，经过若干次分裂后，卵原细胞停止分裂，开始生长，向初级卵母细胞过渡。
此阶段的卵细胞为第I时相卵原细胞，以第I时相卵原细胞为主的卵巢称第I期卵巢。
2. 小生长期是卵母细胞的生长期，开始时，细胞质呈微粒状，细胞核卵形，占卵母细胞的大部分，其内壁四周排列着许多小核（或称核仁），中央为粒状的染色质，有时细胞质中可见卵黄核。
卵母细胞进一步发育，卵膜外出现了一层滤泡膜，由单层上皮细胞组成，内有长形的核。
小生长期发育到单层滤泡为止，这时的卵母细胞，称为卵母细胞成熟的第n时相，以第n时相卵母细胞为主的卵巢称为n期卵巢。
性未成熟的鱼，常有相当长的时期停留在n期。
第一时相图（1-3）：卵母细胞一般出现在体长为 6.0 cm 以下的当年生幼鱼卵巢中。
生殖上皮具有2—3 层增殖分生而成的密集的卵原细胞, 其大小不一。
胞径3.6—16.0卩m胞核2.5 —10.0卩m,浅紫色，可见交织状粗丝形染色质（图1）,附于生殖上皮的第 1 时相卵母细胞形态不规则, 浅紫色, 具 1 个巨大的深紫色核仁（图2）。
基质中第 1 时相的卵母细胞长椭圆形, 质膜外出现一层滤泡膜, 具2— 4 个深紫色滤泡细胞（图3）。
第二时相（4-7）（1）早期图: 卵母细胞排列紧密, 形态不一;多数呈多角形、少数为卵圆形。
细胞核透亮, 核中染色体逐渐解散, 但仍可看到呈细丝状残迹。
胞质显嗜碱性, 成细颗粒状分布。
核椭圆, 染色浅。
核仁大小不一, 数量增多, 一般位于核膜内缘。
单层滤泡膜, 5—7 个扁平滤泡细胞围绕着卵母细胞（图4）。
⑵中期：卵母细胞一般呈椭圆形，胞质深紫色。
核与胞质间形成一条宽为0.2 —0.5卩m勺透明层（图5）, 透明层内物质密度很稀, 显得透亮。
（3）晚期：卵母细胞排列松散。
一般呈圆球形, 胞质呈弱嗜碱性, 油球数量明显增多, 分布均匀。
胞质中出现许多呈网状分布的纤维结构, 在网眼中仍有许多被苏木精染成深紫色的微细颗粒。
锦鲤人工雌核发育早期胚胎观察锦鲤属鲤形目鲤科鲤鱼属，原产于我国，后传入日本[1]，其色彩鲜艳，神态雍容华贵，观赏价值高，是一种高档观赏鱼，也是一种高度杂合体，花色遗传机制复杂。
目前，大部分锦鲤品种主要是通过杂交以及长期人工选育而得到的。
可见，通过纯系亲本来揭示花色遗传机制是目前锦鲤育种方面最亟待解决的问题。
因此，雌核发育在锦鲤选育和亲市品种开发研究方面具有重大意义[2]，它利用灭活的外源精子刺激卵子发育，再通过人工染色体加倍处理获得雌核发育后代，能快速建立遗传纯系，加快发育速度[3]。
目前，我国水产行业中鲤[4-5]、草鱼[6]、白鲫[7]、虹鳟[8]等10多种鱼类进行雌核发育研究，但由于人工雌核发育的孵化率低，在生产上很难推广。
因此，本试验以锦鲤为母本，以灭活的团头鲂精子为外源诱导精子，采用热休克处理假受精卵，受精卵和孵化率分别可达56.54%、 68.71%，并定期观察研究胚胎发育，为今后锦鲤人工雌核发育的推广提供参考资料。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验鱼母本体质健壮，腹部膨大，色泽鲜艳，成熟度一致的2+龄锦鲤，来自湖南省渔缘生物XX公司；父本为2+龄性成熟团头鲂，来自湖南省渔缘生物XX公司。
1.1.2 药品实验室内配制Hanks’液，冰箱4 ℃保存备用。
催产素于注射前配制，现配现用。
1.1.3 设备 Olympus显微镜及其摄像系统，紫外灯2个（30 W），灯架，摇床、纱布，温度计，加热棒，鸡毛等。
1.2 试验方法1.2.1 催产锦鲤亲本进行2针催产，催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等多因素来确定，团头鲂注射1次，用量为锦鲤亲本一半。
锦鲤与团头鲂分池养殖。
1.2.2 精子灭活[9] 人工挤出团头鲂精子（挤之前必须用毛巾擦干净鱼身上的水，沿着胸鳍至泄殖腔轻轻挤压），立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1 ∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成约1 mm的液层，放距紫外线15～20 cm处垫有冰板的摇床上处理10～20 min，显微镜下定期检查精子活性。
金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究摘要开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究，用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子，采用热休克处理卵子使其染色体加倍，获得雌核发育的二倍体金鱼苗。
将假受精的金鱼卵放入室温（21±2）℃室内塑料盒里孵化，10 min 后卵膜吸水膨胀，60 min后开始卵裂，8 h后出现囊胚期，29 h后出现原肠胚期，39 h后出现神经胚期，56.8 h后器官开始形成，3 d后孵化出小苗，受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。
关键词金鱼；人工雌核发育；鲤鱼；胚胎发育金鱼起源于中国，是很受人们喜爱的观赏鱼。
目前大部分金鱼品种主要是通过杂交以及长期人工选育得到的，但变异大、纯度差，不能满足观赏和生产的需要。
雌核发育是特殊的有性生殖方式，属于“染色体组工程”范畴，原理是人工遗传上失活的精子进入未受精的成熟卵，引起卵细胞的发育，是一种快速有效的遗传改良方法[1]。
因此，雌核发育在金鱼选育和新品种开发研究方面具有重大意义。
金鱼与鲫鱼同属于鲤科[2-3]，属不同，亲缘关系较近。
本次试验用鲤鱼的精子诱导金鱼人工雌核发育的方法对金鱼进行遗传改良。
1 材料与方法1.1 试验材料供试雌金鱼购自湖南柳吉现代农业科技有限公司；雄性鲤鱼来自湖南农业大学水产教学基地。
1.2 试验方法1.2.1 人工催产。
在繁殖季节，选取已经达到性成熟的雌金鱼和雄性鲤鱼注射HCG与LHRH-A1合剂进行催熟，约10 h采集精液。
催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等诸多因素来确定，鲤鱼注射1次，用量为金鱼亲本的1/2。
1.2.2 精子灭活。
人工挤出鲤鱼精子，立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成1 mm左右的液层，放距紫外线20 cm处垫有冰板的摇床处理15 min左右，显微镜下定期检查精子活性。
当90%精子失去活性时停止紫外线照射，收集失活精子，储存在冰块中备用。
