北京中医药大学北京中医药研究院动物实验室

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动物购买申请表
申请表编号：20 - -
申请日期：年月日一、基本资料：
项目主持人：单位：北京中医药大学教研室：
项目名称：
经费来源：
联系人：联系人电话：
项目主持人（签章）：主持人电话：
二、申购动物规格：
动物来源：□维通利华□斯贝福□华阜康□其他（请注明）：
动物种类：□小鼠；□大鼠；□豚鼠；□兔；□猫；□其他（请注明）
是否寄养：□是；□否
送货地点：
发票抬头：（开据发票唯一凭证，请慎重、正确填写，因个人填写错误导致的损失，由填表人本人承担）
三、动物中心核定结果：（动物室人员填写）
已订购□；无符合要求的动物□；
动物室收件日期：承办人：
核定日期：。

-基础研究-生盐知母水煎液中芒果昔在大鼠体内的组织分布"唐雅楠，许金凯a ,韩喜桃，韩舒，刘凯洋，支美汝，刘子琴，李卫飞，李飞！，杜红！北京中医药大学中药学院，北京102488［摘要］目的：考察生、盐知母水煎液中芒果昔在大鼠体内的组织分布情况，探讨盐知母引药入肾的作用机制**方法：将40只大鼠随机分为对照组、生知母(10gkg-1)组、盐知母(10g ・kg-1 )组、芒果3( 200 mykg-1 )组， 灌胃给药2 h 后处死，立即解剖采集心、肝、脾、肺、肾组织，采用高效液相色谱法(HPLC )测定组织样品中的芒果 3含量*结果：方法专属性、日内和日间精密度、稳定性及提取回收率均符合生物样品分析要求；各组织样本在检测浓度范围内呈良好线性关系；生、盐知母及芒果3组大鼠给药2 h 内芒果3主要集中在肺、肾组织中，含量从高到低的顺序为肺〉肾>脾>肝>5*结论：生、盐知母和芒果3组大鼠体内芒果3均集中分布在肺、肾组织中，与知母的归经特点相符。

生、盐知母组大鼠体内芒果3在肺、肾组织中的含量明显高于芒果3组，但生、盐知母组大鼠各组织中芒果3含量差异无统计学意义*"［基金项目］国家自然科学基金项目(81774004)$国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项(2016YFE0129000)；国家中药饮片标准化建设项目(ZYYR017R54)* ［通信作者］ 杜红，教授，研究方向：中药炮制学；Tel ： (010)84738616, E-mail : **************.com李飞，教授，研究方向：中药炮制学；E-mail : O668@ sina. comc 并列第一作者［关键词］知母；盐炙；芒果3$组织分布［中图分类号］R285.5 ［文献标识码］A ［文章编号］1673-4890(2021)01-0073-05doi ：10. 13313/j. imn. 1673-4890. 20200221007Tissee Distribution of Mangiferin in Anemarheeae Rhizoma and Sad Shr-friedAnemarrdenae Rhizoma Decoction in RateTANG Ya-nan , XU Jin-kai c , HANXimao , HAN Shu , LIP Kai-2ana , ZH Mei-ru ,LIU Zi-qin , L 【Wei-fei , LI Fed , DU Hong *School O Chinese Materia Medica , Beping Universita ql Chinese MePicioo, Beijing 102488 , China+ Abstrach ］ Objective : To investigate the tissue distribution of mangiferin in rats lter the administration ofAnema R henaeRhizoma and sa.tsti-fied Anema R henae Rhizoma decoction , exp.oRe the mechanism ofsa.tsti-fied Anema R henaeRhizoma.eadingdRugsintothekidneymeRidian. Mehhodt ： 40 Ratswee andom.ydieided intoconto.gRoup , Anema R henaeRhizomagRoup ( 10 g !kg -1 ) , sa.tsti-fied Anema R henaeRhizomagoup ( 10 g !kg -1 ) and mangifein goup( 200 mg !kg -1 ) .TheRats weReexecuted 2 hou safteRintagasticadministation , and immidiate.ydissected.Theheat ,.ieeR , sp.een , .ungand kidneyweeco .ected and thecontentofmangifeRin in theti s uesweRedetemined byhigh pefoRmance.iquid ch omatogaphy ( HPLC ) . Retsdht ： ThemethodXsspecificity , inta-day and inta-day p ecision , stabi.ity , and extaction ecoeeymettheRequiementsofbio.ogica.samp.eana.ysis.Theti s uesamp.esshowed agood .ineaRRe.ationship inthedetection concentation Range.MangifeRin wasmain.yconcentated in the.ungand kidneywithin 2 hou safteRadministationin goupsofAnema R henaRhizoma , sa.tsti-fied Anema R henaeRhizomaand mangifein.TheoRdeRofmangifein contentfom high to.owwas.ung>kidney>sp.een >.ieeR $heat. Concdstnon ： MangifeRin ofth eegoupsismain.yconcentated in.ungand kidney , which isconsistentwith themeidian topism ofAnema R henaeRhizoma.Thecontentofmangifein in .ungand kidneyti s uesofAnema R henaeRhizomagoup and sa.tsti-fied Anema R henaeRhizomagoup issignificant.yhigheRthan thatofmangifeRin gRoup.HoweeeR , theeisnostatistica.di f eencebetween Anema R henaeRhizomagRoup and sa.tsti-fiedAnema R henaeRhizomagoup.+ Keywordt ］ Anemarrhenae Rhizoma $ salt stimfried $ mangiferin $ tissue distribution・73・知母来源于百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、生津润燥的功效［1］*盐知母是知母历代的主流炮制品种，传统理论认为,盐炙可引药入肾⑵。

国家中医药管理局中医药科研实验室名单中国中医科学院TCM-2009-372中药药理（骨伤）实验室中国中医科学院望京医院孔焕宇中国中医科学院TCM-2009-373生物力学实验室中国中医科学院望京医院董福慧中国中医科学院TCM-2009-374中药药代动力学实验室中国中医科学院西苑医院林成仁中国中医科学院TCM-2009-375中药资源生态实验室中国中医科学院中药研究所郭兰萍中国中医科学院TCM-2009-376医学成像和生物物理实验室中国中医科学院针灸研究所张栋中国中医科学院TCM-2009-377中药分析实验室中国中医科学院中医基础理论研究所刘丽梅中国中医科学院TCM-2009-378心血管病证结合关键技术实验室中国中医科学院广安门医院王阶中国中医科学院TCM-2009-379经络穴位形态实验室中国中医科学院针灸研究所罗明富中国中医科学院TCM-2009-380中药安全评价实验室中国中医科学院中药研究所梁爱华中国中医科学院TCM-2009-381中药药代动力学实验室中国中医科学院中药研究所梁日欣中国中医科学院TCM-2009-382中医药信息数字化实验室中国中医科学院中医药信息研究所崔蒙中国中医科学院TCM-2009-383病理实验室中国中医科学院中医基础理论研究所鞠大宏中国中医科学院TCM-2009-384中药生物安全实验室中国中医科学院中医基础理论研究所王克林中国中医科学院TCM-2009-385分子生物学实验室中国中医科学院中医基础理论研究所张杰中国中医科学院TCM-2009-386眼功能实验室中国中医科学院眼科医院巢国俊中国中医科学院TCM-2009-387临床免疫（艾滋病）实验室中国中医科学院广安门医院危剑安。

巨刺阳陵泉穴对MCAO 模型大鼠运动功能作用机制研究谢心悦1，潘彦舒1，方 琪1，王 浩1，刘含之1，王安琪1，江 洋1，孙树勇1，粆 香1，柯雨露1，邹忆怀2（1.北京中医药大学中医学院，北京 100029； 2.北京中医药大学东直门医院，北京 100007）［摘要］ 目的：观察巨刺阳陵泉穴对大脑中动脉栓塞（MCAO ）模型大鼠运动功能障碍的疗效和对胼胝体髓鞘碱性蛋白（MBP ）的影响，探讨巨刺阳陵泉穴改善脑梗死运动障碍的机制。

方法：将68只雄性SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、巨刺组和非经非穴组，每组17只。

除假手术组外，其余三组均用线栓法制备右侧MCAO 模型，术后第2天开始干预，巨刺组电针刺激右侧阳陵泉，非经非穴组电针刺激双侧胁下非经非穴位置，每天1次，每次20 min ，连续14 d 。

测定大鼠抓力、神经功能缺损得分；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC ）染色计算脑梗死体积百分比，苏木精-伊红染色法（HE ）观察胼胝体组织形态，免疫组化、酶联免疫吸附测定（ELISA ）法、蛋白质印迹（WB ）法、反转录聚合酶链反应（RT -PCR ）法分别检测右脑胼胝体MBP 蛋白及mRNA 表达水平。

结果：与假手术组相比，模型组大鼠抓力下降，神经功能缺损得分增加，脑梗死体积百分比增加，胼胝体髓鞘结构崩解，右脑胼胝体MBP 蛋白及mRNA 表达水平降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

与模型组、非经非穴组比，巨刺组大鼠抓力增大，神经功能缺损得分降低，脑梗死体积百分比降低，髓鞘结构较为完整，右脑胼胝体MBP 蛋白及mRNA 表达水平升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

结论：巨刺阳陵泉穴可能通过提高胼胝体MBP 蛋白表达水平促进MCAO 大鼠运动功能康复。

［关键词］ 巨刺；阳陵泉穴；电针；脑缺血；胼胝体；髓鞘碱性蛋白；中风康复；大鼠；大脑中动脉栓塞［中图分类号］ R289.1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007-659X （2024）03-0326-11DOI ：10.16294/ki.1007-659x.2024.03.011Mechanism Study on Effect of Opposing Needling at Yanglingquan Point on Motor Function in Model Rats with Middle Cerebral Artery OcclusionXIE Xinyue 1，PAN Yanshu 1，FANG Qi 1，WANG Hao 1，LIU Hanzhi 1，WANG Anqi 1，JIANG Yang 1，SUN Shuyong 1，CHAO Xiang 1，KE Yulu 1，ZOU Yihuai 2（1.College of Traditional Chinese Medicine ，BeijingUniversity of Chinese Medicine ，Beijing 100029，China ；2.Dongzhimen Hospital ，Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100007，China ）Abstract Objective ：To observe the therapeutic effect of opposing needling at Yanglingquan acupoint［收稿日期］ 2023-08-22［基金项目］ 国家自然科学基金项目（编号：82174331）；北京中医药大学科研纵向发展基金项目（编号：2019-ZXFZJJ -064）［作者简介］ 谢心悦（1996—），女，海南临高人，2020年级硕士研究生，研究方向：中西医结合防治脑病。

㊃基础研究㊃基金项目:中医药防治糖尿病国际联合研究中心(2015B01022)作者单位:100078　北京中医药大学东方医院内分泌科[陈源(硕士研究生)];北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室(吴悠㊁吴丽丽㊁刘铜华),科技处(秦灵灵)作者简介:陈源(1999-),2021级在读硕士研究生㊂研究方向:中医药防治内分泌代谢性疾病的临床与实验研究㊂E⁃mail:1095501378@通信作者:刘铜华(1963-),博士,教授,博士生导师㊂研究方向:中医药防治内分泌代谢性疾病的临床与实验研究㊂E⁃mail:thliu@滋肾丸对KKay 小鼠肝脏胰岛素抵抗以及PI3K⁃Akt⁃FOXO1通路的影响陈源　吴悠　吴丽丽　秦灵灵　刘铜华【摘要】　目的　探究不同剂量滋肾丸水提物对于糖尿病小鼠降糖效果及该药对肝脏胰岛素抵抗的作用机制㊂方法　21只KKay 小鼠随机分为模型组㊁滋肾丸高剂量组和滋肾丸低剂量组,每组7只;7只C57BL /6J 小鼠作为正常组㊂连续灌胃给药6周,滋肾丸高剂量组予2.8g /(kg㊃d),滋肾丸低剂量组予1.4g /(kg㊃d),模型组㊁正常组予等体积蒸馏水㊂观察每周空腹血糖(fasting bloodglucose,FBG),最后一周进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT),酶联免疫吸附法(enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠血清中的空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment⁃insulin resistance,HOMA⁃IR),qPCR 法检测胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)㊁磷脂酰肌醇3⁃激酶(phosphoinositide 3⁃kinase,PI3K)㊁蛋白激酶B(protein kinase B,PKB /Akt)㊁叉头框蛋白1(forkhead box O1,FOXO1)㊁磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)㊁葡萄糖⁃6⁃磷酸酶(glucose⁃6⁃phosphatase,G6pase)㊁葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表达水平;苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin staining,HE)染色和糖原过碘酸雪夫染色(periodic Acid⁃Schiff staining,PAS)观察肝脏病理情况和糖原分布㊂结果　与模型组相比,滋肾丸高剂量组和滋肾丸低剂量组小鼠FBG㊁HOMA⁃IR㊁OGTT 曲线下面积明显下降,肝脏形态学改变部分减少,脂滴减少,糖原分布增加,FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 基因表达均明显下降,滋肾丸高剂量组GCK 基因表达水平显著上升,差异有统计学意义㊂结论　滋肾丸对于KKay 小鼠降糖效果显著,能明显改善肝脏胰岛素抵抗,其机制可能是降低FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 的转录水平,提高GCK 的转录水平,从而抑制糖异生,促进糖原合成有关㊂【关键词】　滋肾丸;　小鼠;　肝胰岛素抵抗;　磷脂酰肌醇3⁃激酶通路;　糖代谢【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2024.03.001Effects of Zishen pill on hepatic insulin resistance and PI3K⁃AKT⁃FOXO1pathway in KKay mice CHEN Yuan ,WU You ,WU Lili ,QIN Lingling ,LIU TonghuaDongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100078,China Corresponding author :LIU Tonghua ,E⁃mail :thliu@【Abstract 】　Objective To evaluate the hypoglycemic effect of the traditional Chinese medicinedecoction Zishen pill on diabetic mice and the mechanism of the drug on hepatic insulin resistance.Methods 21KKay mice were randomly divided into Zishen pill high⁃dosage group and Zishen pill low⁃dosage group,a model group,and 7C57mice as the normal group.After continuous administration for 6weeks,the fasting blood glucose was observed weekly,and the oral glucose tolerance test (OGTT)was performed in the last week of treatment.The enzyme⁃linked immunosorbent assay (ELISA)was used todetect the fasting insulin(FINS)in the serum of the mice in each group and homeostasis model assessment⁃insulin resistance(HOMA⁃IR)was calculated.RT⁃qPCR was applied to detect the mRNA expression of insulin receptor substrate(IRS),phosphoinositide3⁃kinase(PI3K),protein kinase B (PKB/AKT),forkhead box O1(FOXO1),phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK),glucose⁃6⁃phosphatase(G6pase),glucokinase(GCK).Hematoxylin⁃eosin staining(HE)and periodic acid Schiff staining(PAS)were used to observe the liver morphology and glycogen distribution.Results　Compared with the C group,the FBG,HOMA⁃IR,and area under curve(AUC)of OGTT in groups H and L decreased significantly,the changes in liver morphology of C group was partially diminished in Zishen pill treated groups,with fewer lipid droplets and more glycogen distribution.The gene expression of FOXO1, PEPCK,and G6pase decreased significantly,and the expression of GCK gene in group H increased significantly.Conclusion　The Zishen pill has obvious hypoglycemic effect on KKay mice,and can significantly improve hepatic insulin resistance.The mechanism may be due to its effect of reducing the transcription of FOXO1,PEPCK,G6pase and increase the transcription of GCK,thereby inhibiting gluco⁃neogenesis and promoting glycogen synthesis.【Key words】　Zishen pill;　mouse;　hepatic insulin resistance;　PI3K pathway;　glucose me⁃tabolism 糖尿病是一类以高血糖和糖脂代谢障碍为特征的代谢性疾病,中医认为其核心病机为 阴虚燥热”[1⁃2]㊂滋肾丸是一首中医经典名方,方中只有知母㊁黄柏㊁肉桂三味药,常用于淋证㊁癃闭等肾系疾病㊂方中知母㊁黄柏滋阴清热,肉桂反佐,基本符合糖尿病病机㊂前期动物实验已经证实滋肾丸具有一定的降糖效果,如郭晓媛[3]用滋肾丸醇提取物对db/db小鼠干预四周后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平开始下降,并能减轻糖尿病肾病肾小管早期肾损害,改善肾功能㊂Tang 等[4]将db/db小鼠分成滋肾丸三个剂量组,发现其显著降低小鼠血糖及糖化血红蛋白水平,并改善其糖耐量,其降糖效果可与罗格列酮不相上下㊂实验室前期研究发现滋肾丸可通过增加Occludin 和ZO⁃1蛋白在肠道中的表达来增强肠道屏障功能和降低全身炎症,改善骨骼肌形态,调节骨骼肌胰岛素信号通路[5]㊂肝脏也是胰岛素的重要靶器官之一,本研究将基于肝脏胰岛素通路,进一步验证其在自发性糖尿病动物模型KKay小鼠中的降糖作用,以及探讨其改善肝脏胰岛素抵抗的机制㊂1　材料与方法1.1　实验动物KKay小鼠21只,5周龄;C57BL/6J小鼠7只,5周龄,由北京华阜康生物科学有限公司提供,饲养于北京中医药大学SPF级动物房,室温(25±2)℃,相对湿度(50±5)%,昼夜循环12小时/12小时人工光照条件下,自由饮水,正常维持饲料喂养㊂普通饲料为小鼠全价营养颗粒饲料,KKay小鼠专用高脂饲料由北京华阜康生物科学公司提供(货号:1042)㊂1.2　伦理审查本研究的动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准(伦理号:BUCM⁃4⁃2019031003⁃1089)㊂1.3　实验药物知母㊁黄柏㊁肉桂中药饮片购买于北京同仁堂制药公司㊂滋肾丸水提物提取:将中药饮片知母300g㊁黄柏300g㊁肉桂45g混合,浸泡在10倍药重的蒸馏水中1小时,煮沸45分钟后收集药液㊂再次加入相同体积的水煮沸45分钟,将两次的煎剂一起放入旋转蒸发仪中浓缩至645mL,得到1g/mL浸膏㊂将浓缩的浸膏分装收集在50mL的EP管中并保存在-20℃冰箱中,每次灌胃前纯水稀释㊂1.4　实验仪器与试剂便携式血糖仪(GLUCOCARD01-min plus,日本爱科来医疗科技有限公司,型号:GT⁃1970);酶联免疫检测仪(美国,Promega,型号:E9032);凝胶成像系统(美国,Bio⁃RAD公司,型号: ChemiDocTMXRS);研磨仪(上海净信科技有限公司,型号:JXFSTPRP⁃24);实时荧光定量PCR仪(美国,Thermo Fisher Scientific,型号:7500);台式高速冷冻离心机(美国Sigma Aldrich公司,型号:3K15);紫外分光光度计(瑞士梅特勒⁃托利多国际有限公司,型号:UV5Nano)㊂RNA Easy Fast Tissue/cell Kit(北京天根生化科技有限公司,货号:DP451);HiScript®III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司,货号:R323);GO Taq®RT⁃Qpcr System(美国Promega生物技术有限公司,货号: A6001);小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(美国ALPCO Diagnostics,货号:80⁃INSMSU⁃E01)㊂1.5　造模㊁分组与给药在适应性喂养3周后,所有小鼠禁食不禁水12小时,尾尖采血法测量FBG㊂据FBG及体重结果按随机区组设计将KKay小鼠分为3组:滋肾丸高剂量组㊁滋肾丸低剂量组㊁模型组;C57BL/6J小鼠为正常组㊂滋肾丸高剂量组根据人剂量10g黄柏㊁10g 知母㊁1.5g肉桂,换算小鼠生药给药量2.8g/kg㊂小鼠每天同一时间段灌胃给药一次,滋肾丸高剂量组予2.8g/kg,滋肾丸低剂量组予1.4g/kg,模型组及正常组予等体积蒸馏水,连续给药6周㊂1.6　标本采集第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,摘取眼球取血,置于离心管中,不抗凝,室温下静置30分钟后在4℃,3000r/min条件下离心15分钟,吸取上清液于-20℃保存;取出肝脏,将组织的一小部分固定在多聚甲醛溶液中用于形态学观察,其余部分收集在管中并立即用液氮冷冻㊂1.7　指标检测1.7.1　FBG测定　每周固定时间,将小鼠禁食不禁水12小时,取尾尖血,用葡萄糖氧化酶法测定FBG,采用配套血糖仪及试纸㊂1.7.2　口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)　第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,测小鼠FBG作为0分钟血糖,按2g/kg给小鼠灌胃葡萄糖溶液进行OGTT试验,测定30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖,计算曲线下面积(area under curve,AUC)㊂AUC=0.5×(Bg0min+Bg30min)/2+0.5×(Bg30min+Bg60min)/2+1×(Bg60min+Bg120min)/2其中Bg0min为0分钟血糖,以此类推㊂1.7.3　酶联免疫吸附法测定胰岛素水平　将吸取的血清冷冻保存后检测空腹血清胰岛素(fasting insulin,FINS)水平,并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment⁃insulin resistance, HOMA⁃IR)㊂HOMA⁃IR=FBG㊃FINS/22.51.7.4　肝脏组织染色　新鲜肝脏组织经4%多聚甲醛固定24小时后,石蜡包埋,3~5μm切片,根据苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin staining,HE)染色试剂盒及糖原过碘酸雪夫染色(periodic Acid⁃Schiff staining,PAS)试剂盒使用说明书步骤进行,常规光学显微镜高倍镜镜检,观察肝脏组织形态及糖原分布情况,拍照保存图片㊂1.7.5　qRT⁃PCR法测定相关基因表达水平　将肝脏组织从-80℃冰箱取出,试剂盒提取总RNA,按照PCR操作要求及Promega试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA并扩增,反应条件:50℃2分钟,95℃10分钟,(95℃15秒,60℃1分钟,40循环),95℃15秒,60℃1分钟,95℃30秒,60℃15秒㊂以模型组的基因表达为对照,采用2-△△Ct法计算得到各个样本之间相对的基因表达水平㊂检测基因为胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)㊁磷脂酰肌醇3⁃激酶(phosphoinositide3⁃kinase,PI3K)㊁蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)㊁叉头框蛋白1 (forkhead box O1,FOXO1)㊁磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)㊁葡萄糖⁃6⁃磷酸酶(glucose⁃6⁃phosphatase,G6pase)㊁葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表达水平㊂所测基因引物序列如表1所示㊂1.8　统计学方法实验所得数据均为计量资料,采用SPSS25.0统计软件对数据进行分析,用均数±标准差(x±s)表示㊂空腹血糖㊁糖耐量㊁胰岛素水平及胰岛素抵抗指数指标取每组6只小鼠㊂基因表达量取每组3只小鼠㊂小鼠第2周空腹血糖及OGTT试验中30分钟血糖不满足正态分布,采用非参数检验(Kruskal wallis)分析㊂其他数据采用单因素方差分析,其中小鼠肝组织FOXO1基因表达量及第3㊁4㊁5㊁6周空腹血糖满足正态分布不满足方差齐,组间比较采取Dunnett’st检验;其他数据均符合正态分布及方差齐,组间比较采取LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂2　结果2.1　滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响与正常组相比,模型组小鼠的血糖显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组小鼠在第3㊁5㊁6周血糖显著降低(P<0.05),从第1周开始至用药结束,滋肾丸高剂量组小鼠空腹血糖显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),且下降幅度比滋肾丸低剂量组大㊂见表2㊂2.2　滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响与正常组相比,模型组小鼠的0分钟㊁30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖及AUC均显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组0分钟㊁30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖及AUC均显著下降(P<0.05)㊂见表3㊂2.3　滋肾丸对KKay小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响与正常组相比,模型组FINS水平显著降低(P<0.05),提示早期胰岛调节功能受损;与模型组相比,高㊁低剂量滋肾丸均显著提升FINS水平(P<0.05),考虑滋肾丸可以改善早期胰岛功能㊂与正常组相比,模型组HOMA⁃IR显著升高(P<0.05),提示胰岛素抵抗㊂与模型组相比,高㊁低剂量滋肾丸均显著降低HOMA⁃IR水平(P<0.05),提示滋肾丸可以改善胰岛素抵抗㊂见表4㊂2.4　肝脏组织病理学观察2.4.1　HE染色　光镜下观察小鼠肝脏细胞HE染色情况㊂正常组肝组织肝小叶结构清晰,肝索排列规则整齐,以中央静脉为中心呈放射状分布,未见脂质沉积;模型组肝脏形态紊乱,肝小叶肝索结构消失,肝细胞肿大变性,存在大量脂肪空泡及脂质沉积㊂与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组肝小叶结构较为清晰完整,肝索排列较正常,肝窦排列较为规则,中央静脉结构较完整,空泡样改变明显减少㊂见图1㊂表1　qRT⁃PCR引物序列基因名称上游引物序列(3’-5’)下游引物序列(3’-5’) GAPDH AAGATGGTGAAGGTCGGTGT GCTTCCCATTCTCAGCCTTGIRS⁃1AGCCAGTCTTCATCCAGTTGC AGATCTCCGAGTCAGTCCCACPI3K⁃ca ATTTGGCTATAAGCGGGAAC TTGCTAGGTAAGCCTTGTAACACAkt2CACCCTTCAAACCTCAGGTCAC GTCCAGGCTGTCATATCGGTC FOXO1CCTAATTCGGTCATGCCAGCGTA CCGTTGACCGAAGCCGTTTGCK CTTATGGCTGCTACTTCGTTC CTTCTAGTGCAGCAAAAGCG PEPCK CCTCAGCTGCATAACGGTCT CTGAGCATTGCCTTCCACGAACG6pase ACCTCGTCTTCAAGTGGAT GACTTCCTGGTCCGGTCTC表2　滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响(x±s,mmol/L)组别鼠只第0周第1周第2周第3周第4周第5周第6周正常组6 4.50±0.76 3.80±0.10 3.40±0.51 3.75±0.36 3.80±0.45 3.30±0.47 3.30±0.37模型组69.10±2.74a 6.90±2.12a8.70±1.74a11.73±2.34a9.80±2.37a10.70±3.62a9.60±1.14a 滋肾丸低剂量组69.00±1.87a 6.10±0.88a7.50±1.93a8.92±1.84ab8.10±3.10a 6.80±2.21ab 6.80±1.01ab 滋肾丸高剂量组68.90±0.97a 5.20±1.04b 5.90±1.47b 6.97±1.96ab 5.20±1.41b 5.70±1.85b 6.40±2.03ab 注:与正常组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂表3　滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响(x±s)组别鼠只0分钟(mmol/L)30分钟(mmol/L)60分钟(mmol/L)120分钟(mmol/L)AUC 正常组6 3.35±0.4112.35±1.487.00±0.40 4.38±0.6714.16±0.79模型组610.80±3.23a32.53±1.21a29.65±1.32a21.85±3.61a51.73±3.57a 滋肾丸低剂量组6 6.20±0.95ab23.33±1.74b17.95±1.26ab9.03±1.93ab32.75±4.04ab 滋肾丸高剂量组6 5.47±1.08b23.19±3.65b16.53±5.81ab9.08±3.83ab31.40±9.70ab 注:与正常组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂表4　滋肾丸对KKay 小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响(x ±s )组别鼠只FINS(ng /mL)胰岛素抵抗指数正常组623.86±1.090.70±0.11模型组620.65±1.94a 2.00±0.23a 滋肾丸低剂量组622.58±0.84b 1.36±0.16ab 滋肾丸高剂量组623.92±1.22b1.24±0.41ab注:与正常组相比,a P <0.05;与模型组相比,b P <0.05㊂注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组㊂图1　各组小鼠肝脏组织HE 染色(×200)2.4.2　PAS 染色　光镜下观察小鼠肝脏糖原染色,胞质PAS 反应阳性物质即为糖原,显示为紫红色,细胞核为蓝色㊂正常组肝细胞内紫红色糖原颗粒分布均匀,数量适中,提示血糖正常平稳㊂与正常组相比,模型组肝细胞内紫红色颗粒显著减少,提示肝脏糖原合成减弱;与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组紫红色颗粒数量显著增加,提示糖原显著增多,与PCR 结果相一致,表明滋肾丸剂量依赖性促进糖原合成,抑制肝糖输出从而起到降低血糖的作用㊂见图2㊂2.5　滋肾丸对KKay 小鼠IRS⁃1㊁PI3K㊁AKT2㊁FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase㊁GCK 基因表达量的影响与模型组相比,滋肾丸各剂量组FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 的mRNA 表达量均显著降低(P <0.05),且滋肾丸高剂量组下降幅度比低剂量组大㊂与正常组相比,模型组FOXO1的mRNA 表达量显著上升(P <0.05),但PEPCK㊁G6pase 的组间差异不符合预期㊂注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组㊂图2　各组小鼠肝脏组织PAS 染色(×200)与正常组相比,模型组GCK mRNA 表达量显著降低(P <0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组GCKmRNA 表达量有上升趋势,但无统计学意义(P >0.05);高剂量组GCK mRNA 表达量显著上升(P <0.05)㊂与模型组相比,滋肾丸给药后IRS⁃1㊁PI3K 及Akt2的mRNA 有上升趋势,但组间差异无统计学意义(P >0.05)㊂见表5㊂3　讨论中药治疗糖尿病具有多通路㊁多靶点的优势特点,在当前时代背景下运用现代技术探究及阐明其内在作用机制是极其必要的㊂滋肾丸是来源于中医古籍中的经典方剂,组方精妙,量小药少而力专,方中以等量知母㊁黄柏为主,二者皆气寒味苦入肾经,泻火坚阴,在组方配伍中常相须而用㊂‘本草经解“言知母 主消渴热中,除邪气”,‘本草经疏“云黄柏 以至阴之气,补至阴之不足,虚则补之,以类相处”㊂二者相合,少佐温阳化气之肉桂共同起到滋阴化气之效,尤宜于消渴病之下消证㊂本实验参考既有文献研究[4],以10∶10∶1.5的比例制成水提物,探究其降糖机制及量效关系,以冀对临床中方剂应用提供帮助㊂表5　滋肾丸对KKay 小鼠肝组织相关靶基因的影响(x ±s )组别鼠只IRS⁃1PI3K Akt2FOXO1PEPCK G6pase GCK 正常组3 1.66±0.320.47±0.130.73±0.060.19±0.020.92±0.15 2.27±0.34 2.19±0.39模型组3 1.02±0.26a 1.01±0.21 1.01±0.15a 1.01±0.19a 1.01±0.13 1.01±0.19a 1.02±0.26a 滋肾丸低剂量组3 1.09±0.38a 1.71±0.61a 1.19±0.23a 0.41±0.06ab 0.52±0.16ab 0.50±0.19ab 1.62±0.31滋肾丸高剂量组31.47±0.161.53±0.36a1.35±0.53a0.29±0.06b0.35±0.22ab0.32±0.09ab1.99±0.77b注:与正常组相比,a P <0.05;与模型组相比,b P <0.05㊂ 肝胰岛素通路有转录水平以及蛋白磷酸化水平两方面的调节作用,相关研究已证实IRS㊁PI3K㊁Akt是通路上的三个重要节点[6]㊂在生理条件下,胰岛素分泌入血后,沿着IRS⁃1/PI3K/Akt2/FOXO1信号通路发生级联反应,首先与肝细胞膜上的特定INSR结合,通过募集底物IRS⁃1,IRS⁃1多个酪氨酸残基磷酸化,募集PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸磷脂酰肌醇,后者进一步与下游Akt结合并磷酸化激活Akt㊂目前发现Akt有3种亚型,Akt1表达于大部分组织,Akt2主要表达于胰岛素效应组织,Akt3则高度表达于脑和睾丸组织[7]㊂目前的研究表明Akt2是葡萄糖代谢所必需的[8]㊂肝脏Akt2激活后进一步磷酸化FOXO1使其失活,从而释放下游糖异生基因转录及抑制葡萄糖产物生成㊂胰岛素通过这些受体激活和信号蛋白的招募/磷酸化,在肝细胞质膜上启动近端胰岛素的一系列蛋白磷酸化反应㊂FOXO1是肝脏胰岛素信号级联的关键一步,是代谢信号到细胞核的延续与转接[9]㊂资料显示,在高脂喂养的小鼠中肝脏FOXO1mRNA表达降低40%也足以降低基础的肝脏葡萄糖生成[10]㊂正常生理条件下,FOXO1停留在细胞核内,进食状态时在胰岛素作用下磷酸化失活从细胞核转移到细胞质,从而禁用其转录因子活性;在糖代谢紊乱及炎症状态下,FOXO1会发生细胞核移位从而被激活,激活的FOXO1结合转录辅激活因子过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α[9](peroxisome proliferator⁃activated receptorγcoactivator⁃1α,PGC1⁃α),以协调糖异生转录程序,可以靶向提高PEPCK㊁G6pase两个关键酶的基因表达水平来促进糖异生㊂活性FOXO1还与辅阻遏子SIN3A结合,降低GCK 的表达,进一步促进葡萄糖输出[11]㊂GCK是己糖激酶的一种,仅存在于肝细胞和胰岛β细胞中,具有绝对专一性,其作用是催化葡萄糖生成葡萄糖⁃6⁃磷酸(glucose6⁃phosphate,G6p)㊂后者是糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的底物,也是别构激活剂[12⁃13],可以促进糖原合酶的激活,提高糖原合成水平㊂GCK还受血糖浓度影响,在生理条件下,高血糖也可导致葡萄糖激酶从细胞核转移到细胞质[14],从而促成葡萄糖⁃G6p流动㊂GCK 催化G6p的生成同时也是有氧氧化的开始,所以GCK同时控制着肝脏葡萄糖的利用与储存[3]㊂目前GCK已成为潜在的治疗靶点,且已经出现了小分子的激活剂[15]㊂本实验以基因突变的KKay小鼠为2型糖尿病对照,在遗传易感的基础上饲以高脂饲料[16],造成外周组织对胰岛素敏感性降低,与人类2型糖尿病表现极为相似㊂实验结果表明,滋肾丸可显著降低KKay小鼠的FBG㊁OGTT AUC及HOMA⁃IR,PCR显示滋肾丸可以降低小鼠FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase基因表达,提高小鼠的GCK基因表达,另外通过PAS 染色也证实给药后肝脏糖原增加㊂这些证据均提示药物可能通过降低FOXO1从而上调GCK基因表达㊁下调糖异生酶基因表达,抑制糖异生及促进肝糖原合成,从而改善肝脏胰岛素抵抗,降低血糖水平,可能跟IRS⁃1⁃PI3K⁃Akt2胰岛素信号通路有关㊂PCR结果提示上游IRS⁃1㊁PI3K㊁Akt2基因表达水平改变无统计学意义㊂考虑到胰岛素在上述位点的作用与转录后蛋白磷酸化有关,仍需完善蛋白免疫印迹实验进一步验证㊂此外,滋肾丸复方成分复杂,本实验只探索了该复方对胰岛素通路上的其中一条进行了研究,有可能还涉及到其他的胰岛素通路,仍有待进一步探索㊂参考文献[1]　赵进喜,王世东,张丽芬.糖尿病相关中医病名考辨[J].辽宁中医杂志,2005,32(9):889⁃890.[2]　张伯礼,薛博瑜.中医内科学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2002:292.[3]　郭晓媛.滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究[D].北京:北京中医药大学,2021.[4]　TANG Y H,SUN Z L,FAN M S,et al.Anti⁃diabetic effects ofTongGuanWan,a Chinese traditional herbal formula,in C57BL/KsJ⁃db/db mice[J].Planta Med,2012,78(1):18⁃23. [5]　吴悠,陈源,胡耀木,等.滋肾丸对db/db糖尿病模型小鼠肠道屏障功能及骨骼肌转录组的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):22⁃32.[6]　Taniguchi C M,Emanuelli B,Kahn C R.Critical nodes insignalling pathways:insights into insulin action[J].Nat Rev MolCell Biol,2006,7(2):85⁃96.[7]　常盛.PI3K/Akt信号通路与胰岛素抵抗的研究进展[J].中医药导报,2008,14(7):113⁃116.[8]　Héron⁃Milhavet L,Franckhauser C,Rana V,et al.Only Akt1isrequired for proliferation,while Akt2promotes cell cycle exitthrough p21binding[J].Mol Cell Biol,2006,26(22):8267⁃8280.[9]　丁雷.苦瓜醇提物调节ZDF大鼠肝脏糖脂代谢的机制研究[D].北京:北京中医药大学,2020.[10]　Samuel V T,Choi C S,Phillips T G,et al.Targeting FOXO1inmice using antisense oligonucleotide improves hepatic andperipheral insulin action[J].Diabetes,2006,55(7):2042⁃2050.[11]　Langlet F,Haeusler R A,Lindén D,et al.Selective Inhibitionof FOXO1Activator/Repressor Balance Modulates HepaticGlucose Handling[J].Cell,2017,171(4):824⁃835. [12]　Seoane J,Gómez⁃Foix A M,O'Doherty R M,et al.Glucose6⁃phosphate produced by glucokinase,but not hexokinase I,promotes the activation of hepatic glycogen synthase[J].J BiolChem,1996,;271(39):23756⁃23760.[13]　查锡良,药立波.生物化学与分子生物学[M].第8版.北京:人民卫生出版社,2014:50.[14]　Iynedjian P B.Molecular physiology of mammalian glucokinase[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(1):27⁃42. [15]　赵文丽,苏畅,李美英.治疗2型糖尿病药物葡萄糖激酶激活剂的研究进展[J].国际药学研究杂志,2009,36(6):452⁃456.[16]　樊怡欣.四种茶类对自发性2型糖尿病KKay小鼠降糖作用的比较研究[D].北京:北京中医药大学,2011.(收稿日期:2023⁃03⁃08)(本文编辑:张楠)。

兽医学（中医药）实验室被认定为“北京市重点实验室”
佚名
【期刊名称】《北京农学院学报》
【年(卷),期】2006(21)4
【摘要】近日，在学校申报、论证答辩、专家评议的基础上，北京市教委、北京
市科委决定认定北京农学院“兽医学（中医药）实验室”为“北京市重点实验室”。

“兽医学（中医药）实验室”的申报成功标志着学校学科建设取得重要进展，对北京农学院的学科建设、科学研究和研究生教育将起到积极的推动作用。

【总页数】1页(P57-57)
【关键词】重点实验室;北京市科委;中医药;兽医学;北京农学院;学科建设;研究生教育;科学研究
【正文语种】中文
【中图分类】TP316.81
【相关文献】
1.北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室中医内科学北京市重点实验室 [J], 北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室
2.兽医学(中医药)北京市重点实验室的管理体制探讨 [J], 郑一淳;穆祥
3.兽医学中医药北京市重点实验室 [J],
4.兽医学中医药北京市重点实验室未来五年的研究方向 [J],
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1288　环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July 2023,Vol.16,No.7㊃辨证保健专题㊃基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1706800)作者单位:100029　北京中医药大学中医学院[扈觐玺(硕士研究生)㊁刘佳琪(硕士研究生)㊁邵紫萱(硕士研究生)㊁李丽(硕士研究生)㊁冯颖童(硕士研究生)㊁刘双巧(博士研究生)㊁贾岚㊁王景霞]作者简介:扈觐玺(1995-),2021在读硕士研究生㊂研究方向:中药药性理论研究㊂E⁃mail:673813949@通信作者:王景霞(1976-),博士,教授,博士生导师㊂研究方向:中药药性理论研究㊂E⁃mail:wjx20131210@黄芪石斛方对小鼠免疫功能的影响扈觐玺　刘佳琪　邵紫萱　李丽　冯颖童　刘双巧　贾岚　王景霞【摘要】　目的　观察黄芪石斛方对正常小鼠免疫功能的影响㊂方法　80只昆明小鼠均分为A㊁B 两批,共设置7个试验,每批试验将40只昆明小鼠随机分为空白对照组和黄芪石斛方低(1.833g /kg)㊁中(3.667g /kg)㊁高(5.5g /kg)剂量组,每组10只,每天灌胃给药1次,持续30天㊂检测黄芪石斛方对小鼠免疫器官指数㊁迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity,DTH)㊁抗体生成细胞数㊁脾淋巴细胞转化能力㊁血清溶血素水平(serum hemolysin level,HC 50)及自然杀伤细胞(natural killer cell,NK 细胞)活性等指标的影响㊂并采用比色法检测血清中免疫球蛋白IgG㊁IgM㊁IgA 含量,免疫比浊法检测血清中补体C3㊁C4含量㊂结果　与空白对照组相比,黄芪石斛方对胸腺指数㊁脾脏指数均没有影响,各剂量组攻击前后足跖厚度差值㊁溶血空斑数㊁HC 50㊁脾淋巴细胞转化值与NK 细胞活性水平显著升高(P <0.05,P <0.01),血清中IgG㊁IgM㊁IgA㊁补体C3㊁补体C4含量显著升高(P <0.05,P <0.01)㊂结论　黄芪石斛方可通过健脾补肾㊁益气养阴增强机体免疫功能,适用于中医脾肾不足㊁气阴两虚证候的亚健康人群㊂【关键词】　亚健康;　脾肾不足;　气阴两虚;　黄芪石斛方;　免疫功能【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.07.002Eeffects of Huangqi Shihu recipe on the immunity of miceHU Jinxi ,LIU Jiaqi ,SHAO Zixuan ,LI li ,FENG Yingtong ,LIU Shuangqiao ,JIA Lan ,WANG Jingxia Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100029,China Corresponding author :WANG Jingxia ,E⁃mail :wjx20131210@【Abstract 】　Objective To observe the effect of Huangqi Shihu recipe on immune function ofnormal mice.Methods A total of 7experiments were set up,each experiment randomly divided 40KMmice into 4groups:blank group and Huangqi Shihu recipe high⁃dose,medium⁃dose and low⁃dose groups,with 10mice in each group.The drug was given once a day by gavage for 30days,Huangqi Shihu recipe high,medium and low dose groups were given Huangqi Shihu recipe suspension 5.5g /kg,3.667g /kg,1.833g /kg and the blank group was given the same volume of distilled water.To detect the effects of Huangqi Shihu recipe in mice on immune organ index,delayed allergic reaction,splenic lymphocyte trans⁃formation ability,number of antibody⁃producing cells,serum hemolysin level and natural killer cell (NK)activity etc.The contents of immunoglobulin IgG,IgM and IgA in serum were determined by colorimetry.The contents of complement C3and C4in serum were detected by enzyme immunoassay.Results Compared with the blank group,Huangqi Shihu recipe had no effect on thymus index and spleen index.The difference of foot thickness before and after attacked,the number of hemolytic plaque,serumhemolysin level (HC 50),splenic lymphocyte transformation value and NK cell activity level were significantly increased in each dose group(P <0.05,P <0.01).Serum levels of IgG,IgM,IgA,complement环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.71289C3and complement C4were significantly increased(P<0.05,P<0.01).Conclusion　Huangqi Shihurecipe can promote the immune function of normal mice by regulating cellular immunity,humoral immunity,NK cell activity and complement system.It is suitable for subhealthy people with deficiency ofspleen and kidney and deficiency of Qi and Yin in TCM.【Key words】　Sub⁃health;　Deficiency of spleen and kidney;　Deficiency of Qi and Yin;　Huangqi Shihu recipe;　Immunologic function 当代社会竞争日趋激烈,工作生活压力增大,精神紧张,作息不规律等诸多因素,导致部分人群处于免疫力低下的亚健康状态[1],而增强免疫力类保健食品是一种安全增强免疫力,改善亚健康状态的有效措施㊂黄芪石斛方是在中医辨证保健理论[2]指导下,基于未病先防的思想,针对免疫功能低下人群属脾肾亏虚者而设,选择具有健脾补肾,益气养阴功效的黄芪㊁女贞子㊁西洋参㊁铁皮石斛配伍而成㊂本研究按照‘保健食品检验与评价技术规范“[3]评价黄芪石斛方增强免疫力的保健功能,探讨 健脾补肾,益气养阴法”与增强免疫力的关系,为黄芪石斛方精准应用于免疫力低下人群,降低患病风险提供依据㊂1　材料与方法1.1　实验动物80只SPF级雄性昆明小鼠,体质量18~22g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,许可证号: SCXK(京)2019⁃0010㊂动物饲养于北京中医药大学动物实验室的屏障环境中,室温为(24±2)℃,空气相对湿度为(60±10)%,光照12小时/天,自由饮水㊂动物伦理审批号:BUCM⁃4⁃2019110201⁃4032㊂1.2　实验药物黄芪(批号:200602CP273)购自河北万修药业有限公司;女贞子(批号:201201)㊁西洋参(批号: 201101)购自珠海市健兴药业有限公司;铁皮石斛(批号:20201201)购自云南天泉生物科技股份有限公司㊂制备:由北京中医药大学中医临床药学实验室制备,按3∶3∶2∶3比例称取黄芪㊁女贞子㊁西洋参㊁铁皮石斛,经水提㊁浓缩㊁干燥㊁粉碎等工艺制得干膏粉,作为受试物㊂1.3　主要试剂刀豆蛋白A(Sigma,批号:L6397)㊁MTT(阿拉丁,批号:D274386)㊁二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(阿拉丁,批号:D103272)㊁乳酸脱氢酶(Sigma,批号:L1254)㊁PMS(Sigma,批号:P9625)㊁氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(Sigma,批号:P9625)㊁Tris(阿拉丁,批号:T105289)㊁NH4Cl(阿拉丁,批号: A116370)㊁血清溶血素水平(serum hemolysin level, HC50)试剂盒(华英生物,批号:20220725)㊁免疫球蛋白A(华英生物,批号:20220915)㊁免疫球蛋白G (华英生物,批号:20220915)㊁免疫球蛋白M(华英生物,批号:20220915)㊁补体C3(华英生物,批号: 20220915)㊁补体C4(华英生物,批号:20220915)㊁肿瘤坏死因子α(华英生物,批号:20220910)㊁γ干扰素(华英生物,批号:20220910)㊁白细胞介素2 (interleukin2,IL⁃2)(华英生物,批号:20220910)㊁绵羊红细胞(华英生物,批号:20220915)㊁正常豚鼠血清(华英生物,批号:20220915)㊁都氏试剂(海标科技,批号:20220805H)㊂1.4　主要仪器电子天平(FA1004,上海力辰邦西仪器科技有限公司)㊁CO2培养箱(QP50,山东博科)㊁酶标分析仪(DR⁃200BS,华卫德朗)㊁数显游标卡尺(精密度0.02mm,ASOne)㊁微量注射器(50μL,sigma⁃aldrich)㊁移液器(10μL㊁20μL㊁100μL㊁200μL㊁1000μL,Eppendorf)㊁HT7700型透射电子显微镜(TEM,日本日立公司)㊁neofuge15R型冷冻离心机(heal force公司)㊂1.5　实验分组及给药方法80只小鼠随机均分为A㊁B两批,设小鼠迟发型变态反应㊁脾淋巴细胞转化实验㊁抗体生成细胞检测实验㊁血清溶血素测定实验㊁自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)活性测定㊁血清免疫球蛋白含量和补体含量测定7个试验,A批进行迟发型变态反应㊁抗体生成细胞检测实验㊁血清溶血素测定实验,B批进行脾淋巴细胞转化㊁NK细胞活性测定以及血清免疫球蛋白含量和补体含量测定㊂两批小鼠适应性饲养7天后,每批根据随机数字表法分为4组即空白对照组㊁黄芪石斛方低(1.833g/kg)㊁中(3.667g/kg)㊁高剂量(5.5g/kg)组(以生药量计,每日灌胃剂量为人体用量10㊁20㊁30倍),每组10只㊂空白对照组小鼠灌胃等体积的蒸馏水,各剂量组小鼠灌胃相应的黄芪石斛方溶液,1290　环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.7灌胃量为0.1mL/10g体质量,连续给药30天㊂1.6　检测指标与方法1.6.1　胸腺指数与脾指数　称取小鼠体质量㊁脾脏重量㊁胸腺重量,计算脾指数与胸腺指数㊂脾指数=脾脏重量/体质量;胸腺指数=胸腺重量/体质量㊂1.6.2　迟发型变态反应实验　小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)进行免疫㊂免疫4天后,使用数显游标卡尺测量左后足跖厚度并在测量部位注射20%(v/ v)SRBC,于24小时后测量左后足跖部厚度,两次测量均为同一部位测量三次,取平均值㊂结果以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值表示㊂1.6.3　抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)　小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC进行免疫㊂5天后将小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏磨碎制成细胞悬液,调整细胞浓度为5×106/mL,与加入Hanks液的表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100 mL)混合均匀倾倒于刷琼脂糖薄层的玻片上放入二氧化碳箱中孵育1~1.5小时,然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内,继续温育1 ~1.5小时后,计数溶血空斑数㊂1.6.4　血清溶血素测定　小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC进行免疫,5天后取血分离血清,设样品孔和空白对照孔,样品孔:取血清用SA 缓冲液稀释后依次加入SRBC,补体(用SA溶液按1∶8稀释)㊂空白对照孔:除不加入血清外同样品孔㊂置37°C恒温培养箱中保温30分钟后,冰浴终止反应㊂水平离心10分钟后分别取样品孔和空白孔上清液加入另一个96孔板内加入都氏试剂㊂同时设半数溶血孔[加入10%(v/v)SRBC再加入都氏试剂]㊂用震荡器充分混匀,放置10分钟后,于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值㊂溶血素的量以HC50表示,按下列公式计算㊂HC50=样品光密度值SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数1.6.5　ConA诱导脾淋巴细胞转化实验(MTT法)　小鼠于给药第30天颈椎脱臼处死㊂无菌取脾,制备脾细胞悬液㊂将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,一孔加ConA液另一孔作为对照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培养72小时㊂培养结束前4小时,每孔吸去上清液,加入不含小牛血清的RPM1640培养液,同时每孔加入MTT继续培养4小时㊂培养结束后,每孔加入酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解㊂随后分装至96孔板中,每孔作3个平行孔,于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值㊂用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力㊂1.6.6　NK细胞活性实验　小鼠于给药第30天颈椎脱臼处死㊂无菌取脾,制备脾细胞悬液㊂取靶细胞和效应细胞加入U型96孔板中,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液,靶细胞最大释放孔加2.5%Triton,上述各项均设三个平行孔于37℃㊁5% CO2培养箱中培养4小时,然后将96孔培养板离心并每孔吸取上清液置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液反应5分钟,每孔加入1mol/L的盐酸溶液30μL,在酶标仪490nm处测定光密度值㊂并按照下式计算NK细胞活性㊂NK细胞活性(%)=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100% 1.6.7　血清生化指标测定　小鼠于给药结束后,眼眶取血,室温放置1小时,4°C3000r/min离心15分钟分离血清备用㊂采用比色法检测血清中免疫球蛋白IgG㊁IgM㊁IgA含量,免疫比浊法检测血清中补体C3㊁C4含量㊂1.7　统计学方法实验数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS Statistics20.0进行统计分析,数据进行正态分布及方差齐性检验㊂数据呈正态分布,组间数据比较用单因素方差分析(One⁃way ANOVA)分析,两两比较方差齐时采用LSD进行统计分析;方差不齐采用Dunnett’s T3进行统计分析㊂各统计结果以P<0.05为差异有统计学意义㊂数据不符合正态分布,用中位数(四分位间距)描述,用非参数检验作显著性分析,用Kruskall wallis H Test作多重比较,P<0.05为差异有统计学意义㊂2　结果2.1　黄芪石斛方对动物脏器/体质量比值的影响与空白对照组比较,黄芪石斛方各剂量组小鼠胸腺脏器指数与脾脏器指数差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1㊂表1　黄芪石斛方对小鼠胸腺指数和脾指数的影响(x±s)组别鼠只胸腺指数(mg/g)脾指数(mg/g)空白对照组10 1.83±0.90 2.62±2.41黄芪石斛方低剂量组10 1.97±0.70 1.97±0.70黄芪石斛方中剂量组10 2.00±1.24 2.00±1.24黄芪石斛方高剂量组10 2.16±0.85 2.16±0.85环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.712912.2　黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠足跖厚度差值和抗体生成细胞的影响与空白对照组比较,黄芪石斛方低㊁高剂量组足跖厚度差值显著升高(P<0.05,P<0.01),低㊁中㊁高剂量组溶血空斑数均显著升高(P<0.05,P<0.01)㊂见表2㊁3㊂表2　黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠足跖厚度的影响[M(P25,P75),mm]组别鼠只DTH空白对照组100.313(0.156,0.400)黄芪石斛方低剂量组100.499(0.322,0.597)b 黄芪石斛方中剂量组100.178(0.096,0.455)黄芪石斛方高剂量组100.458(0.263,0.656)a 注:与空白对照组比较,a P<0.05,b P<0.01㊂表3　黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠抗体生成细胞的影响(x±s)组别鼠只空斑数/105脾细胞空白对照组10485.31±358.57黄芪石斛方低剂量组101187.25±659.91a黄芪石斛方中剂量组101189.75±677.94a黄芪石斛方高剂量组101351.33±663.24b 注:与空白对照组比较,a P<0.05,b P<0.01㊂2.3　黄芪石斛方对SRBC免疫小鼠血清溶血素水平㊁脾淋巴细胞增殖㊁NK细胞活性的影响与空白对照组比较,黄芪石斛方中㊁高剂量组血清溶血素水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),低㊁中㊁高剂量组脾淋巴细胞转化值显著升高(P<0.01),NK细胞活性显著升高(P<0.01)㊂见表4㊂2.4　黄芪石斛方对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响与空白对照组比较,黄芪石斛方低㊁中㊁高剂量组血清IgG㊁IgM㊁IgA含量均显著升高(P<0.01),结果见表5㊂2.5　黄芪石斛方对小鼠血清补体含量的影响与空白对照组比较,黄芪石斛方低㊁中㊁高剂量组血清C3㊁C4含量均显著升高(P<0.05,P<0.01),结果见表6㊂表6　黄芪石斛方对小鼠血清补体含量的影响(x±s,g/L)组别鼠只C3C4空白对照组100.62±0.160.07±0.01黄芪石斛方低剂量组100.74±0.07a0.09±0.04a 黄芪石斛方中剂量组100.75±0.06b0.09±0.03b 黄芪石斛方高剂量组100.73±0.09a0.07±0.01a 注:与空白对照组比较,a P<0.05,b P<0.01㊂3　讨论免疫力是免疫系统抵抗疾病的能力,人体具有一套完整的免疫防护系统如胸腺㊁脾脏㊁淋巴结㊁淋巴组织等[4],以及执行免疫功能的免疫活性细胞如T细胞㊁B淋巴细胞㊁巨噬细胞等[5],这些免疫活性细胞在神经㊁体液及免疫系统的自身调节下,相互表4　黄芪石斛方对SRBC免疫小鼠血清溶血素㊁淋巴细胞增殖能力㊁NK细胞活性的影响(x±s)组别鼠只HC50OD差NK细胞活性(%)空白对照组1046.16±2.580.142±0.03016.70±4.16黄芪石斛方低剂量组1046.90±4.090.274±0.051b32.05±6.96b 黄芪石斛方中剂量组1052.15±7.74b0.228±0.076b30.45±8.45b 黄芪石斛方高剂量组1050.80±5.04a0.237±0.048b31.86±8.65b 注:与空白对照组比较,a P<0.05,b P<0.01㊂表5　黄芪石斛方对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响(x±s,g/L)组别鼠只IgG IgM IgA 空白对照组10 1.75±0.460.16±0.04 1.28±0.22黄芪石斛方低剂量组10 2.91±0.74a0.45±0.17a 1.78±0.37a 黄芪石斛方中剂量组10 3.43±0.79a0.51±0.15a 2.23±0.45a 黄芪石斛方高剂量组10 2.67±0.61a0.40±0.15a 1.74±0.30a 注:与空白对照组比较,a P<0.01㊂1292　环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.7协调,执行自己的职能,以保证人体处于一个自身稳定的正常状态㊂若免疫功能受损,机体免疫力下降,则不能正常发挥免疫功能,对细菌㊁病毒等病原微生物的抵抗能力降低从而容易罹患感冒㊁肝炎㊁结核等感染性疾病㊂现代医学免疫力的概念与中医理论所述的 正气”相似,正气是相对邪气的称谓,泛指人体正常的生命物质及其功能活动,以及基于此而产生的各种维护能力,包括自我调节㊁适应环境㊁抗病祛邪和康复自愈等能力,是人体生理功能状况的总称[6]㊂中医学认为 正气存内,邪不可干”,正气是人体感邪后发病与否,疾病转归㊁预后好坏的关键㊂正气的旺盛依赖于正常的脏腑生理功能和充沛的气血津液以及精微物质㊂若脏腑功能正常,气血充盈,阴阳平衡,则外邪难以入侵,疾病就无从发生㊂因此,中医主要通过调节脏腑功能,补益气血,来维持机体内在的阴阳平衡,从而达到提高免疫力的作用㊂‘金匮要略“提出扶正祛邪以调补脾肾为主,五脏中首重脾肾㊂肾为先天之本[7],正气之根,所以肾为免疫的生化之源,肾气足,肾精充,方可正气旺,免疫强,不仅少受邪气侵袭,还可祛邪于外㊂脾胃为后天之本[8],气血生化之源,所以脾为免疫的物质基础㊂脾气健旺,运化有度,免疫活性物质正常产生,机体免疫功能运作正常,反之脾气虚则导致免疫功能低下[9]㊂脾肾相互资生,相互促进,即 先天促后天,后天滋先天”,健脾补肾对于调节免疫功能平衡至关重要㊂在现代医学中根据免疫器官功能不同,分为中枢免疫器官和外周免疫器官,两者通过血液循环和淋巴循环互相联系㊂其中中枢免疫器官包括骨髓和胸腺,外周免疫器官包括淋巴结与脾脏[10]㊂‘黄帝内经“中指出 肾主骨生髓”[11],中医理论认为骨髓功能的正常与否和肾精气充盛与否相关联,所以中医理论中的补肾健脾与现代医学中增强中枢和外周免疫器官功能思路相得益彰㊂黄芪石斛方由黄芪㊁西洋参㊁铁皮石斛㊁女贞子四味中药组成,其中黄芪甘微温,入脾经,能补气健脾,生津养血,滋养后天之本,使气血生化有源以不断充养先天;西洋参甘苦凉,归肾经,能大补元气,补气养阴,清热生津;石斛甘寒,归胃㊁肾经,能益胃生津,滋阴清热;女贞子甘苦凉,归肝㊁肾经,药性和缓而持久,功善滋补肝肾,清退虚热,补中有清,为一味清补之品㊂诸品合用,共奏健脾补肾,益气养阴之功,且补中有清,滋而不腻,无温燥上火之弊端㊂现代研究显示,黄芪[12⁃13]㊁西洋参[14⁃15]㊁铁皮石斛[16]㊁女贞子[17⁃18]均具有增强机体免疫力的作用㊂且黄芪和女贞子配伍可以显著提高环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能,同时可以提高小鼠血清溶血素抗体水平及增强二硝基氯苯所致迟发型超敏反应[19]㊂国家市场监督管理总局查询数据显示,截至2023年2月,153项已批含铁皮石斛的保健食品中有62项包含铁皮石斛和西洋参配伍,徐建华[20]通过对小鼠和家兔的研究证明铁皮石斛与西洋参单用及合用均具有养阴生津的功效,同时发现两药合用时有协同作用㊂杨明晶[21]研究发现铁皮石斛和西洋参配伍可有效促进小鼠淋巴细胞增殖能力,提高产生抗体细胞和血清溶血素的功能,增强其NK细胞活性㊁腹腔巨噬细胞吞噬能力㊂这些研究也为黄芪石斛方用于增强机体的免疫力提供了理论依据㊂B淋巴细胞受到抗原刺激后会增殖分化出大量浆细胞,浆细胞可合成和分泌多种免疫球蛋白,免疫球蛋白是机体体液免疫重要组成部分㊂IgG㊁IgM㊁IgA属于免疫球蛋白中最重要的几种类型㊂其量的变化可以一定程度反映B淋巴细胞功能进而反映机体体液免疫功能[22]㊂补体C3是补体系统的核心[23]为补体系统经典激活与替代激活途径过程的关键成分㊂补体C4是经典途径中第二个被激活的补体分子,其被活化后裂解成的C4b片段主要参与经典途径中C3转化酶和C5转化酶的形成,介导补体后续成分的级联反应[24],在30多种补体蛋白中,补体C3㊁C4与补体总水平趋势一致,可反映补体系统的状态,继而反映机体免疫功能状态[25]㊂本实验中IgG㊁IgM㊁IgA㊁C3㊁C4水平均有不同程度的升高,说明黄芪石斛方可能通过调节B淋巴细胞分泌和补体系统来增强机体免疫功能㊂本研究根据‘保健食品功能检验与评价方法“(2022年版)征求意见稿评价要求,证明黄芪石斛方可增强小鼠迟发型变态反应,促进小鼠抗体细胞生成,提高血清溶血素水平;增强NK细胞活性;提高脾淋巴细胞转化率及血清中部分免疫球蛋白含量,说明本方能通过改善体液免疫㊁细胞免疫,增强NK 细胞活性,调节补体系统,从而增强机体中枢和外周免疫器官功能,达到增强机体免疫力的效果,符合 健脾补肾,益气养阴”的中医治法㊂在实际应用中,对于脾肾不足㊁气阴两虚的体质,表现为神疲乏环球中医药2023年7月第16卷第7期　Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.71293力㊁自汗心悸㊁气短㊁口干口渴㊁食欲减退㊁盗汗㊁手足心热㊁面色白等的亚健康人群更为适宜㊂参考文献[1]　张冀东,王丹,何清湖,等.中医亚健康学学科内涵与外延的探讨[J].中华中医药杂志,2021,36(7):3777⁃3781. 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•2670 •t1华中医药杂志(原中国医药学报)2021年5月第36卷第5期CJTCMP，May 2021，Vol.36, No.5•优博专栏.利用广泛靶标代谢组学表征熊胆粉对大鼠胆汁酸组的影响曹姘，宋月林，李军(北京中医药大学中药学院中药现代研究中心，北京100029)摘要：0的：构建全面的胆汁酸组定量表征方法，探究熊胆粉对大鼠胆汁酸组的影响，方法：通过混合不同 时间点的大鼠血浆样品构建模式样品，利用预测多反应离子监测模式结合高分辨质谱分析模式样品中的胆酸类成分，构建定制胆汁酸组检测方法。

然后用该方法分析熊胆粉给药后72h内大鼠血浆中胆汁酸组含M变化，结合主成分分析找出显著变化的胆酸类成分，构建胆汁酸组“迁移路径”，分析熊胆粉对大鼠胆汁酸组的影响结果：通过构建裂解曲线获得胆汁酸磺酸化和葡萄糖醛酸化产物特征离子对的最佳碰撞能，从模式样品中初步鉴定出78种胆酸类成分。

并发现熊胆粉给药后会引起胆汁酸组显著扰动，I2h时变化最大，然后逐渐恢复至生理状态。

结论：本研究构建了78种胆酸类成分的定量表征方法，发现熊胆粉可能通过纠正病理状态下受扰动的胆汁酸组而发挥疗效，为阐明熊胆粉利胆保肝的药效物质和作用机制奠定基础，关键词：广泛靶标代谢组学；熊胆粉；胆汁酸组；模式样品；主成分分析；迁移路径基金资助：国家A然科学基金项目（No.81773875, N〇.81973444)Effects of bear bile powder on bile acids pool in rats by widely targeted metabolomicsCAO Yan,SONG Yue-lin,LI Jun(Modem Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Meteria Medica, Beijing University ofChinese Medicine, Beijing 100029, China )Abstract: Objective: To propose a strategy enabling bile acids (BAs)-focused quantitative metabolomics and subsequently to lucubrate BA pool fluctuation trajectory in rats after dosing Bear bile powder (BBP). Methods: A so-calleduniversal metabolome standard (UMS) sample containing numerous natural BAs was built by mixing rat plasma samples atdifferent time points, in-depth chemical characterization was conducted for UMS to capture as many BAs as possible. Predictivemultiple-reaction-monitoring (pMRM) with enhanced product ion (EPI) experiment was performed on Qtrap-MS for miningBAs, and IT-TOF-MS was deployed to provide high-resolution m/z values for precursor and fragment ion species. The validatedquantitative program was then applied to pursue BA pool shift trajectories in 72h in BBP- and vehicle-treated rats, the significantlychanged BAs were found out combined with principal component analysis. Results: Optimum collision energy for certain BAswere obtained and a total of 78 bile acids were characterized in UMS. Mild variations were observed for the quantitative pattern ofBA pool from vehicle group, whereas BBP could significantly enlarged the entire BA pool, and the pool showed recovery tendencyuntil 12h after gavage. Conclusion: In current study, a strategy allowing simultaneously quantitative analysis of as many as 78 BAswas proposed by successively conducting in-depth qualitative characterization and comprehensively quantitative analysis. And thetherapeutic benefits of BBP should rely on their potentials of holistically rectifying the perturbed BA pool at pathological status.More importantly, the strategy offers a high-quality analytical choice for in-depth quantitative profiling of BA pool as well as fortemporal BAs-targeted metabolomics.K e y W o r d s:Widely targeted metabolomics; Bear bile powder; Bile acid pool; Universal metabolome standard;Principal component analysis; Shift trajectoryFunding! National Natural Science Foundation of China (No.81773875, No.81973444)熊胆粉是熊科动物黑熊Selenarctos thihHanus干燥而得到的粉末。

当归补血汤配伍剂量变化对血虚模型小鼠红细胞相关指标影响的研究摘要：目的：探讨当归补血汤配伍剂量变化对血虚小鼠红细胞的作用差异并找出其最佳配比。

方法：选用乙酰苯肼（aph）和环磷酰胺（ctx）造小鼠血虚模型，同时灌服不同配伍剂量的当归补血汤，测定小鼠的红细胞相关指标的水平。

结果：当归补血汤各剂量组小鼠的红细胞计数（rbc）、血红蛋白（hb）、红细胞压积（hct）均有不同程度的提高，其中当归补血汤1∶5剂量组效果最佳。

结论：当归补血汤中当归与黄芪的比例为1∶5时，对复合化学损伤型血虚小鼠的红细胞相关指标的的治疗效果最好。

关键词：当归补血汤不同配比红细胞计数（rbc）血红蛋白（hb）红细胞压积（hct）doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.003【中图分类号】r4 【文献标识码】a 【文章编号】1671-8801（2013）07-0004-01当归补血汤是一首金元时代源出李东垣《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》的补血方剂，具有益气生血功效[1]。

本方现代主要用于治疗贫血、白细胞减少症、对抗放化疗副作用等[2]。

后人对当归补血汤的配伍比例[3]、药效、主治等有许多争议。

本次实验通过对当归补血汤配伍剂量变化对血虚模型小鼠红细胞相关指标影响的研究，探讨其不同配伍剂量对血虚小鼠红细胞的作用差异并找出其最佳配比，为临床治疗化疗型血虚证用药提供实验依据。

1 实验材料1.1 实验药品。

乙酰苯肼（aph），国药北京化学试剂公司产品，casno：114-83-0；环磷酰胺（ctx），sigma公司产品，casno：6055-19-2；当归、黄芪购于北京同仁堂药店。

1.2 实验动物：小鼠，体重18g～22g，清洁级，雌雄皆用，共85只，由北京中医药大学医学动物实验中心提供。

1.3 实验仪器：全自动血液细胞分析仪，由北京中医药大学医学动物实验中心提供；实验室离心机，由北京中医药大学医学动物实验中心提供；一次性定量取血管。