离子交换层析法

离子交换层析法一、原理离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

二、方法与步骤：1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂......2.实验步骤（1）装柱：取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积;（2）柱的平衡与上样：用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;（3）洗杂蛋白：用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（4）解离目的蛋白（洗脱）：分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;（5）柱的清洗与保存：用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

离子交换层析法阳离子交换剂吸
离子交换层析法是一种常见的分离和纯化技术，其中阳离子交
换剂被用于吸附和分离带正电荷的离子或分子。

这种技术的原理是
利用固定在固体支持物上的功能基团与待分离物质之间的离子交换
作用来实现分离。

阳离子交换剂通常具有负电荷的功能基团，比如
硫酸基团或羧基团，能够吸附和固定带正电荷的离子或分子。

在离子交换层析法中，样品溶液首先被通过固定有阳离子交换
剂的柱子或床层，带正电荷的离子或分子会与交换剂上的负电荷功
能基团发生离子交换，被吸附在固相上，而不带电荷或带负电荷的
物质则会通过柱子流出。

随后，通过改变溶液的pH值或者使用盐溶
液来洗脱被吸附的阳离子，从而实现对目标物质的纯化和分离。

离子交换层析法在生物化学、药物制备、环境监测等领域有着
广泛的应用。

它可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、药物等生物大
分子，也可以用于水处理、废水处理、土壤污染物分析等环境领域。

采用不同类型的阳离子交换剂，可以实现对不同种类离子或分子的
选择性吸附和分离，因此具有很高的应用灵活性和可塑性。

总的来说，离子交换层析法作为一种有效的分离和纯化技术，
阳离子交换剂在其中起着至关重要的作用，通过离子交换作用实现对带正电荷离子或分子的选择性吸附和分离，具有广泛的应用前景和重要的科学意义。

离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

⒈离子交换剂预处理和装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。

阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。

已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。

为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。

柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。

样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。

为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。

柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。

为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。

由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。

最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。

该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。

离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。

层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。

通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。

离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。

在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。

【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。

【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。

近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。

1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。

作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。

存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。

在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。

简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。

本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。

50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。

目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。

离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。

电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。

平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。

平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。

从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。

也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。

离子交换层析法原理离子交换层析法是一种重要的分离和纯化技术，广泛应用于化学、生物、药物和环境科学领域。

本文将介绍离子交换层析法的原理、机理和应用。

一、离子交换层析法原理离子交换层析法是一种基于离子交换反应原理的分离技术，其原理基于离子交换树脂的性质。

离子交换树脂是一种能吸附并释放离子的高分子材料，它的吸附和释放能力是基于它具有的一些离子交换位点。

离子交换树脂具有大量的芳香环和带有离子交换位点的官能团，当它被置于带有离子的溶液中时，这些离子会被交换树脂上的离子吸附。

离子交换树脂中的离子交换位点通常是带有正电荷（即类阳离子）或负电荷（即类阴离子），当它接触溶液中带有相反电荷的离子时，会发生离子交换反应。

离子交换层析的过程可以被简化为以下几个步骤：1. 样品溶液通过离子交换树脂床，离子与交换树脂发生离子交换反应，产生电荷交换和吸附现象；2. 样品中的目标化合物在交换树脂中发生吸附，而不被其他杂质物质吸附；3. 没有被吸附的多余杂质和其他成分，通过交换树脂床，进入下一步；4. 目标化合物从交换树脂中洗脱并获得高纯度的目标产品。

这种分离技术因其高效、快速、具有选择性和可重复性，已经成为了现代分离和纯化技术的标准之一。

二、离子交换层析法机理离子交换层析方法背后的分离机制基于离子交换平衡。

在离子交换树脂与带有离子的样品溶液接触时，树脂吸附并交换样品中的离子。

在样品中，溶液中的离子可以是正离子或负离子，具有相反的电荷。

交换树脂中的离子交换位点可以分为阴离子和阳离子交换位点。

因此，当样品中的阳离子被交换树脂的阳离子交换位点吸附时，它们被离子交换位点中的阴离子排斥。

相反，当样品中的阴离子被交换树脂的阴离子交换位点吸附时，它们则被阳离子排斥。

通过控制离子交换树脂的交换位点和样品溶液中的离子类型，可以实现不同目标化合物的纯化和分离。

控制离子交换树脂的性质，例如选择性、交换率和饱和度等参数，可以进一步优化纯化过程并提高产品的质量。

四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。

蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。

然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。

为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。

在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。

1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。

这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。

在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。

随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。

目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。

亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。

然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。

亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。

2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。

凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。

较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。

较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。

凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。

然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。

3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。

四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。

这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。

层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。

本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。

这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。

一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。

该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。

被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。

该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。

样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。

一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。

显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。

TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。

优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。

TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。

缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。

TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。

二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。

此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。

通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。

该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。

GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。

离子交换层析操作方法离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、核酸等。

其原理是利用固定在固相上的离子交换剂与样品中的离子之间发生物理吸附和解离平衡，通过调节其溶剂系统、pH值、盐浓度等条件，使样品中的不同离子以不同的速率从固相上解离下来，从而实现分离目标分子的目的。

离子交换层析操作可以分为以下几个步骤：1. 样品处理：样品的处理对于离子交换层析的成功与否至关重要。

通常情况下，样品需要经过蛋白质提取等步骤，获得纯净的样品溶液。

如果样品中含有较高浓度的盐类等杂质，可以通过浓缩、洗涤等方法去除。

2. 选择合适的离子交换剂：离子交换剂的选择是根据样品中所含离子的性质来决定的。

对于阴离子，通常选择带有正电荷的阳离子交换剂（如硫酸树脂、乙二胺树脂等）；对于阳离子，通常选择带有负电荷的阴离子交换剂（如盐酸树脂、硝酸树脂等）。

3. 准备离子交换柱：选择合适的柱子尺寸和填充物，通常为高分子量亲水性凝胶。

将填充物装入离子交换柱中，并保持均匀填充。

4. 培养条件：根据样品特性和目的，设置适当的培养条件。

其中包括pH值、溶剂系统和盐浓度。

这些条件的选择需要根据样品的性质（酸碱性，亲水性等）和需要分离的目标纯化物的性质来确定。

5. 样品加载：将经过处理的样品加入离子交换柱，采用适当的流速保持平衡。

溶剂的选择和流速的控制主要是为了交换离子的速率与静电吸附的速率之间达到适当的平衡。

6. 洗脱：通过改变培养条件或溶剂梯度洗脱目标分离物和杂质。

通常使用梯度洗脱的方式，即梯度调整溶剂中的离子浓度，以促进目标物质逐步从离子交换剂上脱附。

7. 浓缩和储存：将洗脱得到的目标分离物浓缩并储存。

离子交换层析操作常见的问题及解决方案：1. 样品中存在杂质：可以通过前处理步骤（如超滤、浓缩等）进行预处理，去除杂质，以保证在交换剂上发生特异性吸附。

2. 分离效果不佳：可以通过改变溶剂系统、pH值或盐浓度等因素来优化分离条件，选取合适的条件以提高分离效果。