紫外可见分光光度法案例

实验四、紫外-可见分光光度法测苯甲酸含量一、实验目的1．学会使用紫外-可见分光光度计，掌握标准对比法。

2．掌握标准对照法曲线的绘制和含量的计算。

二、实验原理在碱性条件下，苯甲酸形成苯甲酸盐，对紫外光有选择性吸收，其吸收光谱的最大吸收波长在225nm。

可采用紫外分光光度计测定物质在紫外光区的吸收光谱并进行定量分析。

三、实验器材试药：0.01mol/L、0.1mol/L氢氧化钠、苯甲酸仪器：量瓶、烧杯、紫外-可见分光光度计四、实验步骤1、苯甲酸标准储备液的制备精确称取苯甲酸100mg，用0.1mol/L氢氧化钠溶液100ml溶解后，再用蒸馏水稀释1000ml。

此溶液1ml含0.1mg苯甲酸。

2、苯甲酸吸收曲线的测量吸取苯甲酸贮备液4.00ml，放入50ml容量瓶中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液定容，摇匀。

此溶液1ml含8μg苯甲酸。

测量条件光源：氢灯；参比液：0.01mol/L氢氧化钠；测量波长范围：210～240nm。

3、标准曲线的制备取标准储备液适量，置于50mL容量瓶中，加0.01mol/L氢氧化钠稀释，分别得到浓度为4、8、12、16、20、24μg.L-1的溶液，取各溶液于“2项”曲线中的最大吸收波长处测吸收度A，得回归方程和相关系数R2。

4、标准对比法测定样品液苯甲酸的含量取10.00ml样品液，放入50ml容量瓶中，用0.01mol/L氢氧化钠定容，摇匀。

在上述曲线中找出最大吸收波长，以此作定量分析的入射光。

以0.01mol/L氢氧化钠溶液为参比。

在完全相同的条件下测出标准苯甲酸溶液和稀释好的样品液的吸光度值。

5、按“3项”所得回归方程计算样品液中苯甲酸的浓度。

五、数据处理1）样品液中苯甲酸含量试样溶液的吸光度为,从标准曲线上可查得c= mg/ml。

六、思考题1、如果试液测得的吸光度不在标准曲线范围之内怎么办？2、从实验测出的吸光度求苯甲酸含量的根据是什么？如何求得？。

湖北工程学院生命科学技术学院实验报告课程：学号：姓名：分数：实验（三）紫外-可见分光光度计一．实验目的紫外可见分光光度计是一种历史悠久、覆盖面很广、在有机化学、生物化学、药品分析、食品检验、医药卫生、环境保护、生命科学等各个领域的科研、生产工作中都得到了极其广泛的应用。

因此通过此实验，可以了解UVPROBE仪器的实验结构和实验原理，简单操作步骤和注意事项，会用光度计仪器来分析样品镀膜的透射率，来达到工作上对镀膜性质分析的需要。

二．实验原理物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。

由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，而且物质对光的吸收是具有选择性的。

各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。

因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也就是紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。

即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。

三．实验器材及试剂台式电脑，紫外-可见分光光度计，5ppm Cyadox溶液、5ppm邻苯二胺溶液、5ppm 2-硝基酚溶液置于棕色容量瓶中。

四．实验步骤1.首先打开电源的总开关，然后打开电脑，等电脑待机状态的时候再打开光度计仪器的开关。

2.要预热五到十分钟，然后打开软件，进入软件的操作界面。

3.然后初始化，点击菜单的“M”，在“测定”菜单中中的波长范围中改变参数，开始选择900，结束选择300。

紫外可见分光光度计应用案例案例1.肉制品中亚硝酸盐的测定前处理方法：称取5g(精确至0.01g)制成匀浆的试样，置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。

在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。

加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

检测仪器：T9型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）仪器条件（见表1）：表1 测量参数检测界面（见图1）：图1 肉制品中亚硝酸盐的检测界面上图标准曲线中，亚硝酸钠标准系列的质量依次为：0.0μg、2.0μg、4.0μg、6.0μg、8.0μg、10.0μg、15.0μg、20.0μg、25.0μg（100mL容量瓶中）。

方法检出限：该方法检出限为1mg/kg，能够满足《GB 5009.33-2010食品安全国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定第二法分光光度法》的检测要求。

参考标准：《GB 5009.33-2010食品安全国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定第二法分光光度法》案例2.啤酒中甲醛的测定前处理方法：吸取已除去二氧化碳的样品25.00mL移入500mL蒸馏瓶中，加200g/L磷酸溶液20.00mL于蒸馏瓶，接水蒸气蒸馏装置中蒸馏，收集馏出液于100mL容量瓶中（约100mL），冷却后加水稀释至刻度。

检测仪器：T9型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）仪器条件（见表2）：表2 测量参数检测界面（见图2）：图2 啤酒中甲醛的检测界面上图标准曲线中，甲醛标准系列的质量依次为：0.0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、8.0μg（25mL比色管中）。

方法检出限：该方法检出限为0.8μg，能够满足《GB/T 5009.49-2008 发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法（4.4甲醛）》的检测要求。

紫外-可见分光光度计法测定饮料中苯甲酸钠的含量一、实验目的1.了解和熟悉紫外-分光光度计的原理和结构，学习UV-2501的操作。

2.掌握紫外分光光度法测定苯甲酸钠的吸收光谱图。

3.掌握标准曲线法测定样品中苯甲酸钠的含量。

二、实验原理为了防止食品在储存、运输过程中发生腐蚀、变质，常在食品中添加少量防腐剂。

防腐剂使用的品种和用量在食品卫生标准中都有严格的规定，苯甲酸及其钠盐、钾盐是食品卫生标准允许使用的主要防腐剂之一，根据GB2760- 1996规定，碳酸饮料中苯甲酸钠的允许最大使用量为0.2g/kg。

苯甲酸具有芳香结构，在波长225nm和272nm处有K吸收带和B吸收带。

根据苯甲酸（钠）在225nm处有最大吸收，测得其吸光度即可用标准曲线法求出样品中苯甲酸钠的含量。

三、仪器和试剂1.紫外可见分光光度计UV-2501（日本岛津），1.0cm石英比色皿，50ml容量瓶。

2.NaOH溶液（0.1mol/L）3.苯甲酸钠标准溶液的配制(1)苯甲酸钠标准贮备液（1.000g/L）：准确称量经过干燥的苯甲酸钠1.000g（105℃干燥处理2h）于1000mL容量瓶中，用适量的蒸馏水溶解后定容。

该贮备液可置于冰箱保存一段时间。

(2)苯甲酸钠标准溶液（100.0mg/L）：准确移取苯甲酸钠储备液10.00mL于100mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释定容。

(3)系列标准溶液的配制：分别准确移取苯甲酸钠标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL于5个50mL容量瓶中，各加入0.1mol/L NaOH溶液1.00mL后，用蒸馏水稀释定容。

得到浓度分别为2.0 mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L和10.0mg/L的苯甲酸钠系列标准溶液。

4.雪碧（500mL）5.蒸馏水四、实验步骤1.吸收曲线的绘制（1）系列标准溶液的配制50mL瓶编号 1 2 3 4 5 6 100.0mg/L苯甲酸钠标准溶液体积（mL）0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.000.1mol/L NaOH溶液体积（mL） 1.00用蒸馏水容量50.0系列标准溶液浓度（mg/L）0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 记录吸光度A值（2）吸收曲线的测定用某一浓度较高的标准液如4号或5号溶液，于210nm~300nm波长范围内扫描，即的苯甲酸钠的吸收曲线。

分光光度法快速检测饮料中柠檬黄的含量
一实验目的
掌握紫外-可见分光光度计在食品检测中的应用。

二实验原理
柠檬黄的是我国允许使用的合成色素，结构如图1，其在紫外可见区域有特征吸收，可经简单的前处理，通过紫外-可见分光光度计检测其在水系溶液中的含量。

图1
三仪器与试剂
仪器：UV-1240或UV-1801紫外-可见分光光度计计容量瓶
试剂：0.5 mg/ml柠檬黄标准储备液去离子水冰柠味佳得乐（或其他只含柠檬黄食用色素的饮料）
四实验步骤
1 工作曲线溶液的配制
取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml标准溶液溶于25ml容量瓶，去离子水定容。

2 吸收曲线的绘制，找最大吸收波长
去最大溶度的工作曲线溶液，于紫外-可见分光光度计的中进行波长扫描（210nm-500nm），
找出最大吸收波长
3工作曲线的测定
取步骤1配制的标准溶液分别用紫外-可见分光光度计测吸收度，吸光度与浓度线性回归，得出工作曲线方程。

4 样品含量的测定
取待测饮料适量，水浴加热除二氧化碳，放冷，紫外-可见分光光度计测吸收度，根据工作曲线方程算出柠檬黄的含量。

（注：国标规定柠檬黄在饮料用的最大用量为0.1g/1kg）
五思考题
1 本次试验的参比试剂是什么？
2 还有什么方法可以用于饮料中色素的检测。

紫外可见分光光度法测定阿司匹林中水杨酸和乙酰水杨酸的含量一、实验目的1 •掌握用紫外可见分光光度法测定药物中乙酰水杨酸的方法。

2 •学会使用UV-2550紫外-可见分光光度计。

二、实验原理阿司匹林是解热镇痛药，主要成分为乙酰水杨酸，摩尔质量180.16g/mol。

阿司匹林少量水解成水杨酸，因而在阿司匹林样品中混有少量水杨酸。

本实验采用双波长法和校正曲线法。

水杨酸干扰阿司匹林的吸光度测定，在选定的两波长下测定吸光度差值。

配制一系列浓度不同的标准阿司匹林溶液，在测定条件相同的情况下，分别测定其在两个波长下的吸光度，以标准浓度为横坐标，以相应吸光度差值为纵坐标，绘制△ A-C关系图，在相同条件下测出试样在两波长处的吸光度，可从校正曲线上查出试样液的浓度。

Ate■■呻I图1 紫外吸收图谱I, 阿司匹林2*水杨酸三、仪器和试剂1. 仪器UV-2550紫外-可见分光光度计、容量瓶10ml、50ml。

2. 水杨酸标准品1.008mg/ml、阿司匹林标准品1.008mg/ml、阿司匹林样品40mg/ 片、乙醇。

四、实验步骤1.样品溶液、标准溶液的配置：标准溶液的配置：取6个10ml容量瓶，标号1~6。

使用微量进样器精密吸取阿司匹林标准品0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml注入各个容量瓶，95% 乙醇定容。

配置成约40卩l/ml、60卩l/ml、80卩l/ml、100卩l/ml、120卩l/ml 的标准溶液，备用。

并将水杨酸标准品溶液稀释为20 11 l/ml，备用。

样品溶液的配置：取1片阿司匹林研细，加入无水乙醇1~2ml分次研磨，使溶解。

利用滤膜过滤后转入50ml容量瓶中，充分振摇，乙醇定容（浓度：800 1 l/ml ）。

取1ml定容后的样品溶液，转入10ml容量瓶，乙醇定容。

配置成约为80卩l/ml的样品溶液。

2. 波长选择使用紫外-可见分光光度计，先用95汇醇进行基线校正。

用阿司匹林标准品3和稀释过的水杨酸标准品进行光谱测量。

实验四 紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量一、实验目的1、理解紫外—可见分光光度法定性分析、定星分析的原理。

2、掌握紫外—可见分光光度法测定维生素B12含量的原理。

3、掌握UV—7502PC紫外—可见分光光度计的结构、原理与操作。

二、原理分子中的电子发生跃迁需要的能量约在1~20eV之间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱或紫外—可见吸收光谱。

物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。

由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律，即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。

在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。

1. 紫外-可见分光光度计的基本结构紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录系统组成。

图1 紫外—可见分光光度计基本结构图2.透光率和吸光度如图2所示：入射光强度I0，吸收光强度I a，透过光强度I t， 反射光强度为I r I0═ I a + I t + I r被测溶液和参比的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═ I a + I t透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；反之，透光率愈小，溶液对光的吸收愈多透光率的负对数称为吸光度，用符号A 表示。

紫外可见分光光度法实例解析一、原理分析UV-VIS依据电子跃迁光谱，通常分子轨道基态外层电子处在，当分子外层吸收紫外或者可见辐射后，从基态向激发态跃迁。

其中紫外光谱：200~400nm，可见400~780nm。

其定性依据是不同物质对不同波长吸光度不同，定量依据是朗伯比尔定律A= εbc 吸光度分子二、适用范围一般适用于有机物，尤其是含有发色光能团、大共轭体系如含有苯环的有机物的测定三、特点：灵敏度高、选择性好、准确度好、通用性强、操作简单、价格低廉缺点：远不如红外光谱好，很多化合物在紫外没有吸收或者吸收很弱，而且紫外光谱特征性不强。

可以用来检验一些具有大的共轭体系或者发色官能团，并作为其他方法的补充。

四、仪器组成：光源——单色器——狭缝——样品池——检测器五、准备工作实验开始前查相关文献确定显色剂，显色剂：将待测组分形成有色化合物反应类型：络合反应氧化还原反应取代反应缩合反应显色剂选择条件：(1)灵敏度(2)选择性(3)生色物质稳定(4)组成恒定(5)显色剂在测定波长处无明显吸收，有色化合物与显色剂颜色对比大六、实验仪器前期设定：由待测物质查阅相关文献，确定使用可见区还是紫外区，确定光源钨丝或者氢、氘。

由待测物质确定样品池采用紫外区的石英池或者可见区的玻璃池检测器选用光电倍增管达到最佳检测效果七、配置标准检测液、显色剂溶液、参比溶液、标准溶液标准溶液：由分析纯的待测物质配置而成的溶液参比溶液：若仅待测组分和显色剂反应产物有吸收，其他试剂无吸收，用水做参比若显色剂和其他试剂略有吸收，试液本身无吸收，用“试剂空白”（不加试样溶液）参比若待测试液有吸收，而显色剂无吸收，则用“试样空白”（不加显色剂）做参比一般都选用试剂空白，即八、样品前处理，制成相应的溶液，如果其中有干扰离子，则加入掩蔽剂进行掩蔽或者采用化学方法分离出干扰离子九、实验条件确定：(1)最大吸收波长确定取1ml的标准溶液，1ml显色剂配制成溶液，稀释、定容、差文献确定谱线大致范围，多次测定，选择有最大吸收时的波长定为最大吸收波长，并且和标线对比，确定其误差是否在允许范围内，适当控制吸光度在最适范围(2)显色剂用量确定分别取1ml标准液，不同体积显色剂配成溶液，稀释、定容、多次测定得到吸光度-显色剂用量曲线，选择使得曲线平缓的最低用量再增加0.5ml为最佳显色剂用量（设为a ml）(3)显色温度确定取分别取1ml标准液、和a ml的显色显色液，稀释定容，测量在相同时间，不同温度下的吸光度显色时间曲线，得到最适温度T0(4)显色时间的确定分别取1ml标准液、和a ml的显色显色液，稀释定容，恒温T0测量，分在测量得到吸光度-显色时间曲线。