微生物基本试验原理及操作(高教知识)

一、实验目的1. 学习微生物分离纯化的基本方法。

2. 掌握微生物形态观察和菌落特征鉴定技术。

3. 培养微生物实验操作技能，提高对微生物学基本知识的理解。

二、实验原理微生物分离与鉴定是微生物学实验中的基本操作。

通过分离纯化，可以获得单一菌株，便于进行后续研究。

微生物鉴定则是根据微生物的形态特征、生理生化特性等，确定其种类。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂、无菌水、无菌试管、接种环、酒精灯、显微镜等。

2. 实验仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。

四、实验步骤1. 样品采集与处理（1）采集土壤样品，放入无菌试管中。

（2）用无菌水将土壤样品稀释10倍，制成土壤悬液。

2. 分离纯化（1）将土壤悬液取适量，涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上。

（2）将平板倒置放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

（3）观察菌落生长情况，挑取单个菌落，进行纯化培养。

3. 形态观察与菌落特征鉴定（1）将纯化后的菌株涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，37℃培养24小时。

（2）观察菌落形态、颜色、大小、边缘等特征。

（3）将菌落置于显微镜下观察菌体形态。

4. 生理生化特性鉴定（1）根据菌落特征，选取疑似菌种进行生理生化试验。

（2）进行糖发酵试验、氧化酶试验、甲基红试验等。

（3）根据试验结果，确定菌种。

五、实验结果与分析1. 分离纯化经过多次挑取，成功分离出多个单菌落。

2. 形态观察与菌落特征鉴定观察发现，分离出的菌株菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为白色。

3. 生理生化特性鉴定经过糖发酵试验、氧化酶试验、甲基红试验等，确定分离出的菌株为乳酸菌。

六、实验总结本次实验成功分离纯化了土壤样品中的乳酸菌，并通过形态观察、菌落特征鉴定和生理生化特性鉴定，确定了其种类。

在实验过程中，掌握了微生物分离纯化的基本方法，提高了微生物实验操作技能，加深了对微生物学基本知识的理解。

七、注意事项1. 实验操作过程中，严格遵守无菌操作规程，避免污染。

微生物学实验讲义（2008级基地班）任课教师：熊芳教授教化时数：15学时实验周数：4周生物学实验教授教化中间微生物实验目次（15学时）微生物实验差不多常识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：泥土自生固氮菌的分别纯化（5学时）实验三：显微镜的应用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验差不多常识一、实验目标1.熟悉实验室规矩和安稳守则，精确应对实验中显现的不测变乱；2.熟悉微生物学实验室常用仪器和有关试剂的全然常识；3.操纵实验申报的精确书写。

二、实验内容1.实验室规矩；2.实验室安稳守则；3.实验室中不测变乱处理；4.常用器皿及器具；5.显微镜及有关常识；6.实验预习、实验记录和实验申报。

实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌设备培养基的全然流程如下：原料称量→消融→调剂pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、养分成分1. 依照不合微生物的养分须要配制不合的培养基，如自养型微生物的培养基完全能够（或应当）由简单的无机物质构成。

异养微生物的培养基至少须要含有一种有机物质。

碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体供给全部心理活动所须要的能量（异养微生物）。

氮源(nitrogen source) 凡是供给微生物养分所需的氮元素的养分源，称为氮源。

氮源物质的重要感化是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能应用铵盐、硝酸盐作为机体进展的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的前提下，也能够应用氨基酸作为能源物质。

能源指能为微生物的生命活动供给最初能量来源的养分物或辐射能。

2. 留意各类养分物质的浓度与配比养分物的浓度：在一样情形下，浓度合适的养分物质才对微生物表示出优胜感化，浓度大年夜时对微生物进展起克制造用，浓度小时不克不及知足微生物进展的须要。

各养分物质之间的浓度比：培养基中各养分物质之间的浓度比直截了当阻碍微生物的进展与滋长和（或）代谢产品的形成与积聚，专门是碳氮比（C／N）（碳氮比一样指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的阻碍更为明显。

实验一玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌一、目的要求1、熟悉微生物实验所需的各种常用器皿名称和规格；2、掌握对各种器皿清洗方法；3、掌握玻璃器皿的干热灭菌操作过程；4、了解手提式高压蒸汽灭菌锅的结构、使用方法和操作要点。

二、基本原理为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。

保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。

试管和三角瓶要做棉塞。

这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。

因此应看作是微生物实验的基本操作。

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物的营养体，包括芽胞和孢子。

灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。

本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。

通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。

细胞内的蛋白质凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强；湿热的蒸汽有潜热存在，从而增加灭菌效力。

三、实验器材1、吸管，试管，三角瓶，试管刷，棉花，报纸、包扎绳、去污粉等；2、手提式高压蒸汽灭菌锅。

四、实验步骤1、玻璃器皿的洗涤清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。

1）不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用酸性溶液（2%的盐酸溶液）浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。

2）用过的器皿应立即洗涤。

3）强酸，强碱，琼脂等能腐蚀，阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。

一般的器皿都可用去污粉，肥皂或配成5%的热肥皂水来清洗。

油脂很重的器皿应先将油脂擦去。

沾有煤膏，焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂(苯，二甲苯，汽油，丙酮，松节油等)揩去。

医学微生物学实验课件xx年xx月xx日contents •实验准备•细菌的分离与培养•细菌的鉴定•病毒的分离与鉴定•医学寄生虫实验•医学微生物学实验总结目录01实验准备1 2 3通过本次实验，学生将学习到微生物学实验的基本技能，包括实验操作、显微观察、分离培养等。

掌握微生物学实验基本技能通过实验过程中的生理生化反应，学生将了解微生物的生理生化特性，初步掌握微生物分类鉴定的基本方法。

了解微生物的生理生化特性通过本次实验，学生将了解微生物在医学中的应用，包括致病微生物的检测、防治和免疫等方面的应用。

认识微生物在医学中的应用微生物学实验基本原理微生物学实验的基本原理包括显微镜技术、无菌技术、分离培养技术、生理生化反应等。

这些技术的基本原理是进行微生物学实验的基础。

微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应是微生物学实验中的重要内容。

通过观察和测定微生物的生理生化反应，可以初步鉴定微生物的种类和特性。

微生物在医学中的应用微生物在医学中有着广泛的应用，例如致病微生物的检测、防治和免疫等。

通过本次实验，学生将了解这些应用的基本原理和方法。

实验前的准备包括实验器材和试剂的准备、实验室环境的消毒等。

分离培养将样品接种在适宜的培养基上，分离培养出特定的微生物。

样品采集和预处理根据实验目的和要求采集样品，并对样品进行预处理，以备后续实验使用。

生理生化反应将分离培养出的微生物接种在适宜的生理生化反应管中，观察和记录微生物的生理生化反应结果。

显微观察将样品制成涂片或压片，在显微镜下观察微生物的形态和结构。

数据分析和总结对实验数据进行整理和分析，得出结论，并撰写实验报告。

实验步骤02细菌的分离与培养选择适合细菌生长的培养基，通常包含碳源、氮源、无机盐、水等。

培养基成分按照规定的步骤，将所需成分按比例混合、溶化、调PH值、过滤、分装等步骤制备成培养基。

制备流程确保培养基的质量和无菌，需要进行灭菌处理和细菌学检测。

质量控制培养基制备根据不同的分离要求，可采用划线分离法、稀释分离法、组织研磨法等。

微生物的实验实验一油镜的使用方法与革兰氏染色实验目的:掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法实验原理: 革兰染色法⑴革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。

⑵革兰阳性菌等电点（pI 2~3）比革兰阴性菌（pI 4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。

⑶革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。

实验步骤: 1.涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1～2环生理盐水放于载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径１cm左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。

若采用液体培养物，可直接取1～2环菌液涂布。

接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。

2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。

3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。

2.染色(1)初染：滴加结晶紫染液2～3滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min后以细水漫过轻洗，将积水甩干。

(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min后水洗，并将标本片上的积水甩净。

(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间），细水冲洗，甩干。

(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸去积水。

3. 镜检用油镜观察，并判断细菌的染色性。

记录实验结果。

4.实验后处理擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。

注意事项: 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。

高中微生物的培养和使用实验过程微生物的实验室培养一、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

1、种类·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。

·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。

鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

2、、化学成分包括：水、无机盐、碳源、氮源（有些可加生长因子、维生素）等。

·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。

如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。

异养微生物只能利用有机碳源。

单质碳不能作为碳源。

·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。

如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）、蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。

只有固氮微生物才能利用N2。

·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。

例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

3、配置原则（1）目的明确：（2）营养物质要协调，注意各营养物质的浓度和比例（3）PH要适宜，各种微生物适宜生长的PH值范围不同。

二、无菌技术：消毒和灭菌1、消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。

消毒方法：常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

2、灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

目录实验一培养基的配制实验二消毒与灭菌实验三显微镜油浸系物镜的使用实验四细菌形态的观察实验五细菌的革兰氏染色实验六放线菌的形态观察实验七酵母菌的形态观察实验八霉菌的形态观察实验九细菌数量的测定(设计性实验)实验十微生物的接种方法实验一培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配置培养基的一般方法和步骤内容：1、牛肉膏蛋白胨的配制2、高氏1号培养基的配制3、马丁氏培养基的配制二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。

其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.61、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。

牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯，牛肉膏极易吸潮，故称量时要迅速。

2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失水分。

3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。

若偏碱，则用1mol/l HCl进行调节。

PH的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离子的浓度4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。

但是供一般使用的培养基，这步可以省略。

华中大微生物学实验讲解实验一微生物制片及形态观察一、细菌简单染色法及形态观察（一）基本原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

（二）实验材料1．菌种：大肠杆菌、酵母菌的斜面培养物。

2．染色剂：吕氏碱性美蓝、草酸铵结晶紫等。

3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸等。

（三）实验步骤1. 涂片：取一块载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，从菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，并涂成薄膜。

涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

2. 干燥：室温自然干燥或烘干。

3. 固定：涂面朝上，通过火焰2～3次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同时还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。

热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加1~2滴染液于涂片上。

草酸铵结晶紫染色约1 min；若用吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。

5. 水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。

6. 干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。

7. 镜检：涂片干后镜检。

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。