流式细胞仪BDFACSCantoII

FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数【实验原理】：用已知总数的荧光微球Beads 作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B 、NK 细胞的绝对数。

【主要试剂】：（1） 抗体：CD3/CD8/CD45 /CD4；CD3/CD16+56/CD45 /CD19四色荧光抗体。

（2）Trucount tube （内含数量已知的Beads ）。

（3）FACS Lysing Solution （溶血素）（10×,使用前用蒸馏水稀释成1×）。

【实验步骤】：1、 取两支TruCount Tube ，编号A 和B ；2、 用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads ）。

3、 取20ul CD3/CD8/CD45/CD4抗体加入到A 管中、取20ul CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体加入B 中，注意：不要碰到血。

涡旋混匀，室温避光放置15－20min 。

4、 取出加入450ul 1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15min 。

5、 24小时内上机用FACSCanto Clinical 软件获取2500个淋巴细胞进行检测，上机前应充分混匀。

；【注意事项】：1、 样本使用EDTA 抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。

2、 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。

3、 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。

4、 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。

5、TruCOUNT 管2-25°C 保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT 管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT 管应弃去不用。

FACSCanto II开机1．打开电脑，进入Windows系统2．打开主机，激光电源3．登陆FACSDiva软件，等待联机成功4．观察各溶液桶液流情况，作必要添加处理5．Cytometer菜单-Fluidics Startup启动液流实验1．选择合适的Configuration（Cytometer-View Configurations）2．新建实验（需要模板时，选Experiment菜单下的New ****）3．建立Specimen，tube4．在Experiment菜单下Experiment Layout下输入各管标记，设定存储数据量等5．在Global Sheet上画图6．上样I）阴性管调电压，调节FSC/SSC电压，调节阈值，找到细胞群体，设门，调节各荧光的电压至阴性位置，设定界限II）单阳性管调节补偿，注意散射光的变化III）上样本，调节各门的位置，右键点击图形，选择Show Population Hierarchy显示population上下级关系，可以更改显示名称、颜色，作交、并、补集；选择CreateStatistics View显示统计信息，右键点击统计选择Edit Statestics View更改统计内容设置7．导出结果，注意Sheet和Global Sheet差别8．实验条件可以复制粘贴，可以将导出使用各种模板9．注意更换样本管时一定要将支撑臂推到底关机1．使用稀释过的次氯酸钠溶液（有效氯约0.5-1%）1-2ml，放置在上样位置，高速上样运行5分钟；2．使用3ml去离子水，放置在上样位置，高速上样10分钟；3．Cytometer菜单-Fluidics Shutdown关闭液流4．放上约1ml去离子水在上样位置5．关闭Diva软件6．关闭仪器电源7．电脑关机特别维护1．每月可进行一次长清洗：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Long Clean2．每三个月可进行一次流动室清洗：使用流动室清洗液，Cytometry菜单-Cleaning Modes-Clean Flow Cell3．上样针堵塞：Cytometry菜单-Cleaning Modes-SIT Flush，使用稀释的次氯酸钠溶液高速上样半小时，用去离子水冲洗4．排除气泡：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Degas Flow Cell或是Purge Bubble Filter and Degas Flow Cell5．更换液体后：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Prime after tank refill。

流式細胞儀---FACSCanto之基本原理與應用產品專員劉益年美商必帝公司E-mail : kenny_liu@大綱•實驗設計原理•流式細胞儀運作原理•儀器設定調整•開、關機流程實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads Array單一細胞特性之偵測單一細胞特性之偵測cytokinesystructureenzymesAdhesionReceptorsMetabolic淋巴球免疫分型FITC PE使用原理CD45CD14儀器可自動依據CD45與CD14之免疫螢光染色，測量三群白血球的比例，淋巴球(CD45Bright/CD14-/Low FSC/Low SSC)，單核球(CD14+/CD45Intermediate/High FSC/Intermediate SSC)，顆粒性球(CD14dim/CD45dim/High FSC/High SSC)，細胞碎片與紅血球應是(CD14-/CD45-g g)細胞碎片與紅血球應是(/Low FSC/Low SSC)。

IgG1IgG1根據陰性對照組之染色程度來劃分陽性/陰性之界線，依此界線在陰性對照的樣品中，假陽性(Quardrant1+2+4)不得超過百分之二。

CD3CD19T 細胞必須表達有CD3+ 抗原，B 細胞表達有CD19+ 抗原。

此兩群細胞與NK 細胞之總和應約略等於淋巴球的總數，可作為品管的指標。

CD3CD4CD4+T細胞必須同時表達有CD3+與CD4+抗原。

CD3CD8CD8+T細胞必須同時表達有CD3+與CD8+抗原。

CD3CD16+or CD56+NK細胞必須不表達有CD3抗原，同時表達有CD16+或CD56+抗原。

NK細胞與T&B兩群細胞之總和應約略等於淋巴球的總數，可作為品管的指標。

訊息傳導實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayAnnexin V AssayAnnexin V-FITCC a++C a++C a++ C a++conjugateExternalization ofphosphatidylserinePlasmaApoptosismembraneCytoplasm Cytoplasm實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayDNA 特異性染劑EthidiumPropidiumNH 2NH 2NH 2NH 2p N +C 2H 5N +C 2H 2)3N +C 2H 5CH 3C 2H 5細胞周期位相的決定G 2MG 0G 1sG 0G 1Co sG 2Mu n t2004006008001000DNA content2N4NSub G1Sub G1細胞增殖反應實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayCytometric Beads Array (CBA)Cytometric Beads Array (CBA)Single StepIncubationTwo-Step IncubationorBeads Provide a Flexible PlatformBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer platform for use with a flow cytometerMultiple Different Different colors Multiple sizes Different intensities*Different colors with different intensitiesProteins MeasuredProteins MeasuredA. Interleukin (IL)-2B. IL-4C. IL-5D. IL-10E. Tumor Necrosis Factor-αF. Interferon-γBD FACSCanto TMBD FACSCanto TM流式細胞儀流式細胞儀的工作原理的工作原理dynamic Focusing)---液流聚焦(Hydro (Hydro--dynamic Focusing)偵測區-螢光激發光源-散射光樣品流動區緩衝液緩衝液液流區液流區流式細胞儀能測量:•散射光–細胞大小(前方散射光, 2-16°)–細胞折射率(側方散射光, 90)90°•各色螢光綜合三個系統的功能:‧液流系統:將細胞依序送到測量區受檢。

碧迪FACS CantoⅡ流式细胞仪性能评价及实验室应用方佩琪;孙林;顾梅秀;吴蕙;潘柏申;郭玮;王蓓丽【摘要】目的评估碧迪FACS CantoⅡ(BD FACS CantoⅡ)流式细胞仪的性能及实验室应用.方法依据中华人民共和国医药行业新版标准《YY/T0588-2017流式细胞仪》[1]对BD FACS CantoⅡ流式细胞仪进行性能评价,评价内容包括:荧光检出限、荧光线性、前向角散射光(forward scatter resolution,FSC)检出限、仪器分辨率、FSC分辨率、侧向角散射光(side scattering resolution,SSC)分辨率、倍体分析线性、表面标志物检测的准确度、表面标志物检测的重复性、携带污染率和仪器稳定性.完成性能评价后,分别用BD FACS CantoⅡ流式细胞仪及其配套的BD 六色淋巴细胞亚群试剂盒和BD FACS Calibur流式细胞仪及其配套的BD四色淋巴细胞亚群试剂盒分别检测20份全血标本,比较两台仪器在标本前处理、上机检测、分析结果所用时间和结果比较的差异.结果该流式细胞仪对异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)通道荧光检出限为40.18等量可溶性荧光分子数(molecules equiva-lent soluble fluorochrome,MESF),对藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)通道荧光检出限为23.77MESF,两者的决定系数(R square,r)均为0.999 9;FSC最小可检测0.22 μm微球;仪器分辨率FSC,FITC和PE荧光通道的变异系数(coeffivirnt of cariation,CV)分别为2.3％,2.4％和2.4％;FSC/SSC散点图可明显区分外周血中红细胞和血小板,同时能区分白细胞中的淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞;倍体分析线性中G2/M期(四倍体细胞峰)与G0/G1期(二倍体细胞峰)的平均荧光强度比值为1.98;表面标志物检测值的平均值均在质控品说明书给定的靶值参考范围内;表面标志物检测重复性CV分别为CD3∶2.75％,CD4∶1.86％,CD8∶ 5.14％,CD16/CD56∶7.33％和CD19∶11.26％;携带污染率最大为0.05％;该仪器开机8h检测FSC及各荧光通道峰值荧光道数偏差值(B)分别为-0.40％,-0.55％,1.57％,1.88％,1.66％,7.44％,7.23％,6.63％和6.21％;BD FACS CantoⅡ流式细胞仪及其配套试剂盒较BD FACS Calibur流式细胞仪及其配套试剂盒在总体检测速度上有显著提高;两台仪器所得的检测结果差异无统计学意义(P＞0.05),且前者检测结果的离散程度小于后者.结论 BD FACS CantoⅡ流式细胞仪各项性能均符合行业标准,仪器各项技术指标达标,可有效保障实验室检测结果的准确性,能为临床诊疗提供可靠支持.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)002【总页数】6页(P94-99)【关键词】BD FACS CantoⅡ;流式细胞仪;性能评价【作者】方佩琪;孙林;顾梅秀;吴蕙;潘柏申;郭玮;王蓓丽【作者单位】复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032【正文语种】中文【中图分类】R446流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种利用流式细胞仪对单细胞或生物颗粒进行多参数、快速分析的技术[2]。

BD FACSCanto II TM 中文培训手册目 录录FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂试剂 (3)FACSCanto(II)开机程序开机程序 (4)FACSCanto(II)关机程序关机程序 (6)BD FACSCanto 临床软件进行仪器日常质控临床软件进行仪器日常质控（（QC QC））........................ 7 HLA HLA--B27校准校准 (99)FACSCanto Clinical 六色免洗淋巴细胞亚群检测六色免洗淋巴细胞亚群检测 (10)FACSCanto Clinical 软件的获取分析的具体操作软件的获取分析的具体操作 (11)FACSCanto Clinical 软件进行HLA-B27分析分析 (14)Diva 软件进行HLA-B27手动获取和分析手动获取和分析 (18)Calibrite 四色小球模拟细胞演示四色实验演示四色实验样本获取和分析样本获取和分析样本获取和分析 (20)Diva 软件进行单色&双色获取和分析双色获取和分析 (23)Cytometer Setup and Tracking （CS&T ）操作流程操作流程 (24)FACSCanto (II)流式细胞仪HTS 操作规程 (31)FACSCanto(II)日常保养和维护日常保养和维护 (33)FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂1. 普通低速离心机（实验要求为300g,相当于1000～1500rpm，可调转速调时间，能离心12x75mm 的5ml 试管)；2. 固定或可调节的加样器及相应加样头若干： 20ul,50ul, 100ul, 200ul, 250ul，450ul，1ml；3. 旋涡混匀器；4. 烧杯，量筒或移液管，三个清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml)，一个棕色瓶，漏斗，滤纸；5. 300目过滤尼龙网；6. 可放置12x75mm 的5ml 试管的试管架2－3个；7. PBS 溶液和蒸馏水：0.22µm 滤膜过滤；8. NaClO：分析纯，有效氯浓度10%；9. 每天需要一管2ml 的抗凝的人血样本 (最好是EDTA-K 3抗凝)；10.多聚甲醛。

BD FACSCantoⅡ流式细胞仪方法学性能验证陈淑英;陈健;林勇;时朝辉【摘要】Objective To verify the main performance of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer. Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)documents and projects provided from other literatures,the analytical performance of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer was evaluated by precision,accuracy,linearity and reference range of common test items(peripheral blood lymphocyte subtypes:CD3+Tcell,CD3+CD4+T cell,CD3+CD8+T cell,B cell and NK cell). The results were compared with the claims of manufacturers.Results Theprecision,accuracy,linearity and reference range of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer in the determination of peripheral blood lymphocyte subtypes were in line with the performance parameters of manufacturers.Conclusions BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer has a good performance,accurate measurement and a high repeatability in the determination of peripheral blood lymphocyte subtypes,which can satisfy the need in clinics.%目的：对BD FACSCantoⅡ流式细胞仪的主要分析性能进行方法学验证。