山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期）
学院（中心、所）：生物技术研究所
专业名称：微生物学
课程名称：
论文题目：流式细胞仪的原理及其应用
授课教师（职称）：崔晓东
研究生姓名：常姣
年级：研一
学号：201323001003
成绩：
评阅日期：
山西大学研究生学院
年月日
流式细胞仪的原理及其应用
姓名常姣专业微生物学
摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。
关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学
流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。
1流式细胞仪的构成及工作原理
流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。
流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。
2流式细胞仪的应用
流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。
2.1流式细胞仪在生物学中的应用
流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。
2.1.1 对凋亡细胞的分析
细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
细胞内环境稳定等过程中发挥重要作用, 主要是由基因控制的细胞自主性的有序的死亡过程。流式细胞仪检测凋亡细胞的方法包括以下三个方面
2.1.1.1 形态学的检测
凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩、核解聚、凋亡小体形成、胞浆浓缩、体积减小等形态学上的特征, 经过流式细胞仪的前向角散射( forward scatter , FSC) 和侧向散角射( side scatter , SSC)分析后, 即可区分出凋亡细胞和正常细胞，凋亡细胞的典型特征是前向角散射下降和侧向角散射升高[3]。
2.1.1.2 DNA含量分析
在凋亡细胞内，由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成，核内的总DNA 含量下降，应用荧光染料对NA进行标记，可检测凋亡细胞。常用的荧光标记染料有两类：一是可与单体DNA片段结合，这类荧光染料有hoechot33342,4c,6-二眯基-2-苯吲哚( DAPI )及光辉霉素等；一种是可与降解的DNA片段结合，这类荧光染料碘化乙啶( EB)、丫啶橙( AO)等。由于在凋亡细胞内DNA含量下降，在G1峰前出现亚二倍体峰，称亚G1期峰，又称凋亡小峰[3]。
2.1.1.3 DNA断裂点标记法
细胞凋亡的最后阶段是形成DNA片段，DNA断裂点法检测的即是DNA的断裂片段，即标记DNA 断裂的3c -羟基末端，常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口转移( in situ nick translation , ISNT ) 或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记( terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeli ng, TUNEL )技术，ISNT和TUNEL法均可进行间接或直接标记。间接标记物常为生物素化脱氧三磷酸尿苷( biotin- dUTP) 或地高辛配体( Di g) - d U TP 等，此外还需要连霉亲和素或抗Dig dUTP，使标记反应增倍，提高灵敏度；直接标记的标记物常为异硫氰酸荧光素( FITC)-dUTP[3]。
2.1.2 对细胞周期的分析
流式细胞仪对D N A、R N A 含量及细胞周期的分析具有独特的特点: ( 1 ) 测定细胞内D N A 变异系数小, 一般为1% ~ 2% ; ( 2) 可正确分辨二倍体、四倍体、近二倍体及非整倍体, 准确进行细胞周期分析; ( 3 ) 分析数据多、统计结论可靠; ( 4 ) 分析结果直接以图形形式显示,形象直观。
流式细胞仪对细胞周期的分析主要是对单个细胞内D NA 含量的分析, 通过标记物发出红色荧光的强弱可推算出G0、G1 期( 二倍体) 、S 期( 超二倍体) 、G2, M 期( 四倍体) 的比例, 其敏感性和特异性均超过其它方法,其结果以D N A 分布的直方图的形式显示, 进而可计算出G 0/ G1, S / G2+ M 比率来了解细胞的增殖能力, 并可了解细胞的增殖状态。此外, 细胞周期的分析可以准确的反应细胞的异常增殖即癌化的潜在状态, 一般来说, 高S 相比率( S - pha se fr ac r i on, S PF) 和高增殖指数的细胞都可以理解为潜在癌细胞或癌细胞。所以, 流式细胞仪在医学临床上的应用主要集中在癌细胞的早期诊断、鉴别治疗、判断预后及疗效评价等领域[3]。
2.1.3 染色体核型的分析
用流式细胞术可将分离的染色体进行分类、纯化。传统的核型分析在取材、培养、涂片、固定后，用分带技术显示出不同染色体的特征信息，然后再显微照相，放大、剪接、组型。这是一个十分费时且不可避免掺有主观因素的技术。目前, 用仪器自动分型的方法，一是采用图像技术的静态方法，再有就是采用流式细胞术。后者除可做染色体分析外还可纯化，得到克隆实验所要求的染色体，这是其他任何技术都无法完成的，为此设计专门的特种流式细胞计[4]。
2.1.4 在分子遗传学领域中的应用
流式细胞术的分析功能和分选功能在分子遗传学领域很有用处。分析的功能常用来研究分离的染色体，有时也用来检测或定量测量细胞表面或内部为特异基因所编码的细胞分子；分选的功能可用来分选指定的染色体，然后用来建立人类染色体DNA文库[4]。
2.1.5 用于家畜性别的预选择
将家畜的X、Y精子分选出来，达到控制胎畜性别的目的。此外，在精子发生学、睾丸瘤、不育症、药物对精细胞的干扰等研究中，都可使用流式细胞术进行定量研究[4]。
