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流式细胞仪原理及应用精选课件

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流式细胞术原理及应用课件

流式细胞术原理及应用课件
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
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22
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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16
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17
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
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18
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
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8
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
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9
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度

流式细胞术原理及应用 ppt课件

流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
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19
常用荧光素
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20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体

流式细胞仪分析技术及应用PPT课件

流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。

流式细胞仪原理ppt课件

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300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号， 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差

流式细胞仪培训ppt课件

流式细胞仪培训ppt课件

慢性活动性肝 炎、肝硬化
肿瘤
降低
降低 降低
正常或 增高 增高
降低 降低 降低 降低
.
用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原
表达该抗原的细胞被 标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧 光强度强
.
阳性细胞百分 比或浓度
靶蛋白浓度
淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测
收集透镜
光信号收集
3
带通滤波片 光电倍增管
.
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
数据处理
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换 （面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
.
流式细胞仪产生的信号 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
.
荧光信号
FL1 – FITC,GFP…(PMT2) FL2 – PE (PMT3) FL3 – ECD,PI… (PMT4) FL4 – PC5,APC… (PMT5)
633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5
90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI …
.
三、流式细胞仪应用
.
流式细胞仪应用
Ø 淋巴细胞免疫功能测定 Ø 干细胞研究 Ø 细胞增殖与凋亡检测 Ø 细胞周期及倍体分析 Ø 细胞活性分析 Ø 细胞分选 Ø ……
Focused laser beam
流 动 室
.
流式细胞仪光路图
620BP FL3 (ECD)
575BP FL2 (PE)
525BP FL1 (FITC)
Air-cooled Argon Ion Laser

流式细胞术原理及应用通用课件

流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03

04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。

流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件

流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
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LASER
SIGNAL PMT
AMP
computer
LIN
LOG
.
4
滤片
带通滤片 BAND PASS (BP)
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
1000
Log FITC Fluorescence (CD8)
.
17
CD分子(Cluster of differentiation) -------人类白细胞分
化抗原
1982年巴黎首届国际学术会议确定CD命名法 已有200多个分化抗原群被鉴定和命名 已得到WHO有关管理机关批准
.
18
CD抗原及其相关细胞群
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
200
400
600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 深红
PI
488
620
DNA染色 橙红
.
10
EPICS XL 流式细胞分析仪
.
11
BECKMANCOULTER FLOW CYTOMETER
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及应用
.
1
基本原理
光源 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光
流路 流动室(flow cell) 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS • 无颗粒，无荧光本底 • 无菌，稳定的pH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
细胞群
CD抗原
T细胞
CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38
B细胞
CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75
髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35
NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94
血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63
.
20
(一) FCM在临床免疫学中的应用
1.评价机体的免疫功能 (1) 淋巴细胞亚群 ● T细胞： CD3+ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc) ● B细胞： CD19+ ● NK细胞：CD3- CD16+ CD56+
.
21
(2) 淋巴细胞亚群细分 ● T细胞：Ts：CD8+ CD28Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+ ● B细胞：B1：CD5+ CD19B2：CD5 + CD19+
一定波长以上通过，该波长以下折射
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
Light Source
Transmitted Light
Reflected .
5
light
P4 MT
4
Flow Cytometry Principle
Flow cell
Dichroic
PMT
Filters
.
22
(3) 活化淋巴细胞亚群 ● 活化总T细胞： CD3+ /HLA—DR+ ● 静止总T细胞： CD3+ /HLA—DR● 活化CD4+细胞：CD4+ /HLA—DR+ ● 活化CD8+细胞：CD8+ /HLA—DR+ ● 活化诱导分子： CD69 ● 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞
.
23
(4) Ⅰ型变态反应介导分子 ● CD23： IgE低亲和力受体 ● 膜结合：IgE
(5) HLA类抗原 ● HLA-B7 / B-27 ● HLA-DR ● HLA-DP ● HLA-DQ ● HLA-ABC
.
24
(6) 细胞因子受体 ● IL-2 Receptor (CD25) ● IL-12 Receptor ● EGF-Receptor ● TNF-Receptor ● TGFβ-Receptor ● Insulin-Receptor
3
PMT
2
Bandpass Filters
PMT
1
Laser
.
6
OPTICS
.
7
信号
荧光信号
FL1，FL2，FL3，FL4 线性，对数
散射光信号
前向散射光(FS)：细胞大小 侧向散射光(SS)：结构复杂程度
.
8
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
.
9
常用荧光染料的特性
激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97
粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f
内皮细胞 CD105 CD106 CD109
细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126
.
19
流式细胞术的临床应用
临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究
放大部分 光电倍增管PMT HV 放大电路 GAIN 增益 线性：LIN 对数：LOG
统计：计算机
.
2
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
.
3
FLOW CYTOMETRY(FCM)
SAMPLE
600
800
1000
90 Degree Scatter
.
15
Immunophenotyping
HISTOGRAM 单参数直方图
0
15
0
11
0
Count
37
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
.
16
双参数直方图DOT PLOT
1
45%
2
2%
100
10
1
.1
27% 3
26% 4
.1
1
10
100
--------细胞分析领域中的CT 实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析
.
12
细胞的特征与细胞功能
不同细胞的形态学特征 不同细胞的蛋白表达 其它细胞功能特征
.
13
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Immunophenotyping
CD4
CD # = cluster designation number
CD2
.
14
Light Scatter Gating