牛生长抑素基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究周光现;常馨月;阚靖博;张恩平【摘要】试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白.提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamH I和Xho I酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamH I和Xho I双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致；成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta(DE3)菌中成功的进行融合蛋白表达.%This experiment was conducted to obtain the recombinant myostatin by technique of gene engineering.The primers were designed and produced according to Herefords myostatin gene sequence.BamH I and Xho I enzyme cut sites and protective bases were added at the end of the primer respectively.The full fragment gene was cloned by RT-PCR from Qinchuan cattle muscle,and PCR product was cloned into the pMD18-T vector.The recombinant plas-mid pMD18-T was identified with BamH I and Xho I restriction enzyme, and the fragment were collected by agarose gel fraction method.After purification the fragment was ligated to the pGEX4T-l express vector, the recombinant pGEX4T-l express vector was constructed.After transformation, the engineered strain E.coli Rosette (DE3)/GST-M wasexpressed by the induction of IPTG.Sequencing analysis showed that the nucleotide sequence was the same as the published myostatin cDNA sequence 1 128 bp.The express vector pGEX4T-l-M was successfully constructed.The specific approximate 69 ku band was obtained by analysis of SDS-PAGE and GST-tag Western-blotting.The result indicated that myostatin protein had been expressed successfully in Rosetta(DE3) expressing system.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】6页(P13-18)【关键词】秦川牛;肌肉生长抑制素;克隆;原核表达;蛋白印迹【作者】周光现;常馨月;阚靖博;张恩平【作者单位】西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S811.6肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)又称GDF-8，属TGF-β( transforming growth factor beta转化生长因子-β) 超家族，是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白,其功能和表达量的变化可能会通过调节靶基因的表达，改变肌肉的纤维组成(红、白肌的比例)及造成肌肉重量的变化[1]。

生物工程学报 Chin J Biotech 2021, July 25; 24(7): 1180-1185 journals.im.ac Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac © 2021 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析张兵兵1,2, 江鹏1,2, 鲜成玉1,2, 李玉筱1,2, 李大军1,2, 唐丽灵1,2, 王远亮1,21 重庆大学生物工程学院, 重庆 4000302 重庆大学“985工程”生物材料与仿生工程研究中心, 重庆 400030摘要: MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。

通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列,使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。

重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/再对融合蛋白EK酶切, rpHPLCdes(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。

分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。

生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。

关键词: 胰岛素样生长因子-1, 力生长因子, 原核表达, 增殖, 迁移Expression of Mechano-growth Factor in Escherichia coli and Activity Analysis Bingbing Zhang1,2, Peng Jiang1,2, Chengyu Xian1,2, Yuxiao Li1,2, Dajun Li1,2, Liling Tang1,2, and Yuanliang Wang1,21 Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030, China2 National “985 Projiect Programme” Research Center of Bioinspired Materials Science and Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China Abstract: Mechano-growth factor (MGF) is one of IGF-1 isoforms. MGF is mechanosensitive and has important functions in muscle hypertrophy, regeneration and nerve injury recovery. In this study, MGF cDNA (330 bp) was cloned from stretched osteoblasts by RT-PCR. In order to avoid prolin residue inhibiting enterokinase cleavage, 9bp of MGF cDNA 5′ end sequence was truncated by primer, then the obtained truncated MGF (des(1-3)MGF) cDNA (321 bp) was subcloned in pET32a(+) vector to construct a prokaryotic recombination expression plasmid. Trx/des(1-3)MGF fusion protein, existing in formsof solution, was expressed in transformed Escherichia coli strain BL21(DE3) by IPTGinduction at 30oC. The supernatant of cell lysates was subjected to ion exchange chromatography and Ni2+ metal affinity chromatography, and the fusion protein was obtained with the purity over 95%. After the fusion protein was cleaved by enterokinase, Trx and des(1-3)MGF was isolated by reverse-phase HPLC. Through these procedures, des(1-3) MGF was obtained with the purity of 98%. The protein molecular mass was conformity to the theoretical value by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. The purified des(1-3)MGF was incubated with MC3T3-E1 for cell proliferation and migration assays. The results show that des(1-3)MGF exhibited more facilitative effects on proliferation and migration of MC3T3-E1 than that of des(1-3)IGF-1.Keywords: insulin-like growth factor-1(IGF-1), mechano-growth factor (MGF), prokaryotic expression, proliferation, migrationReceived: November 8, 2007; Accepted: January 18, 2021Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30600130). Corresponding author: Yuanliang Wang. Tel: +86-23-65102509; E-mail:cqingzbb@163自然科学 (No. 30600130)资助。

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达倪宏波;宋丽;崔玉东;邵红;李冬野;王喆【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》【年(卷),期】2007(019)006【摘要】根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a(+)质粒连接,构建pET32a(+)-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.【总页数】4页(P46-49)【作者】倪宏波;宋丽;崔玉东;邵红;李冬野;王喆【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列的克隆与原核表达 [J], 左明坤;沈冰蕾;倪洪波2.西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析 [J], 吕文发;赵静;袁天祥3.牛肌生成抑制素功能基因的克隆与原核表达 [J], 倪宏波;宋丽;崔玉东;邵红;李冬野;王喆4.雷琼牛肌生成抑制素基因全序列分析 [J], 常春芳;常洪;冀德君;耿荣庆;李世平;李永红;马国龙;陈宏宇;宋光明5.牛肌肉生成抑制素基因功能区的克隆与原核表达 [J], 吕文发;袁天祥;孔振兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生长抑素(SS)基因在pET 232表达系统中的高效表达刘永庆1,刘文波1,潘杰彦1,杜念兴1,陈溥言13,赵国屏2(11南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京210095;21中国科学院上海生物工程研究中心,上海200233)摘要:分别将SS 基因克隆至p ET 32a 和p ET 32c 表达系统中,得到重组质粒SS 2N/X 和SS 2N/S 。

实验结果表明,SS 2N/X 2Thioredoxin (硫氧还原蛋白)和SS 2N/S 2Thioredoxin 融合蛋白在IPTG (异丙基硫代βD 半乳糖苷)诱导3h 后(37℃)表达产量最高,约占菌体总蛋白的30%左右。

0105～1mmol ・L -1IPTG 对SS 融合蛋白表达产量的影响并不太大,0105mmol ・L -1IPTG 即可达到有效的诱导效果,但单位体积内的表达产量以015mmol ・L -1时为最高。

乳糖诱导4h (37℃)的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至8h 时,20mg ・mL -1的乳糖可达到与IPTG 同样的诱导效果,10和5mg ・mL -1的乳糖也可接近IPTG 的诱导效果。

SS 2N/X 融合蛋白在26℃表达时,主要以可溶性形式存在,占7518%,包涵体仅占2412%;而SS 2N/S 融合蛋白则主要以包涵体形式存在,占6012%,可溶性蛋白仅占3918%。

SS 可溶性融合蛋白具有良好的SS 抗原性。

关键词:生长抑素(SS );p ET 32表达系统;异丙基硫代βD 半乳糖苷(IPTG );乳糖;融合蛋白中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01006105Cloning and expression of somatostation (SS)genein E 1coli pET 232expression systemL IU Y ong 2qing 1,L IU Wen 2bo 1,PAN Jie 2yan 1,DU Nian 2xing 1,CHEN Pu 2yan 13,ZHAO Guo 2ping 2(1.Key Laboratory of Animal Diseases Diagnosis &Immunology ,Ministry of Agriculture ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.Shanghai Biological EngineeringResearch Center ,Chinese Academy of Sciences ,Shanghai 200233,China )Abstract :The SS gene was cloned into the p ET 232a and p ET 232c expression system respectively 1Two recombinant plasmids SS 2N/X and SS 2N/S were gained correspondingly.After exposure to IPTG (at 37℃)for 3h ,both of SS 2N/X and SS 2N/S fusion protein expression were accounted for approximately 30%of the total cellular proteins 1The expression level of SS fusion proteins was not significantly altered when the IPTG concentration was varied from 0105mmol ・L -1to 1mmol ・L -11The expression level was monitored after inducing with lactose and IPTGfor 4h.The ex pression level was lower with lactose induction when com pared to that with IPTG.However ,if the induction time was prolonged to 8h ,20mg ・mL -1lactose had similar effect as that of IPTG ,even at lower concentration (510mg ・mL -1)1It showed that 0105mmol ・L -1IPTG could give the satisfactory result.7518%of the SS 2N/X fusion protein was soluble ,while only 3918%of the SS 2N/S fusion protein was soluble at 26℃.Thesesoluble SS fusion proteins had higher antigenicity 1K ey w ords :somatostatin ;p ET 232expression system ;IPTG (isoproylthio 2β2D 2galactoside );lactose ;SS fusion protein垂体生长激素(GH )的分泌受下丘脑GH 释放因子(GHRF )和生长抑素(SS )的双向调控,前者促进GH 释放,后者则抑制GH 释放。

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建韦光辉;徐廷生;雷雪芹;索剑飞【摘要】采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒.通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】3页(P113-115)【关键词】牛生长激素基因;克隆;真核表达载体pEGFP-N1;载体构建【作者】韦光辉;徐廷生;雷雪芹;索剑飞【作者单位】河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003【正文语种】中文【中图分类】S823P;Q782牛生长激素基因(BGH)是由牛脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链多肽类激素,广泛存在于各种脊椎动物中[1]。

BGH由191个氨基酸组成,分子量为22kD。

其主要作用是调节机体物质代谢过程,促进葡萄糖吸收,碳水化合物和脂肪分解、核酸与蛋白质合成,进而提高饲料转化率[2]。

1982年,Palmilter等[3]成功将大鼠生长激素基因转入小鼠受精卵的雄原核中,获得了超级小鼠,个体比对照组增大了1倍。

这些成就使许多研究者认识到转基因技术在个体改造、品种改良方面具有巨大的应用潜力。

之后,对各种动物及以人生长激素基因的转移就成了动物基因工程领域的热点课题。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母,其基因可以在异源组织中表达并产生荧光,表达时不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分,不影响宿主细胞,因而可以鉴定、跟踪、分选表达GFP的活细胞,成为目前国内外生物化学和细胞生物学中最广泛应用的报告基因之一[4,5]。

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达石晓卫;陈其新;王凤云;李明;赵巧辉;刘孟洲【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2008(042)006【摘要】为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30a和pET29a),转化E.coli DH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coli BL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30a-BST和pET29a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30a-BST/RosettaTM和pET29a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.【总页数】4页(P643-645,654)【作者】石晓卫;陈其新;王凤云;李明;赵巧辉;刘孟洲【作者单位】甘肃农业大学,甘肃,兰州,730070;河南农业大学,河南,郑州,450002;河南农业大学,河南,郑州,450002;河南农业大学,河南,郑州,450002;甘肃农业大学,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学,甘肃,兰州,730070【正文语种】中文【中图分类】S823【相关文献】1.牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建 [J], 韦光辉;徐廷生;雷雪芹;索剑飞2.干扰3 T3-L1脂肪细胞生长激素受体对生长激素诱导的细胞炎症因子表达和分泌的影响 [J], 钱慧琳;黄靓;巢汝;周凡;屈顺林;张弛3.诱导表达猪生长激素pGH载体系统构建及其在PK15细胞中表达验证 [J], 白立景;周荣;敖红;鞠辉明;王楚端;李奎4.整合型诱导表达猪生长激素(pGH)载体的构建及表达研究 [J], 鞠辉明;白立景;姜星;李奎5.牛生长激素基因工程菌最佳表达条件的研究 [J], 刘宝先;周顺伍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建康峰;苏广华;苏建国;段彪;王子东;李光鹏【期刊名称】《中国牛业科学》【年(卷),期】2011(037)005【摘要】【Objective】To clone and construct the eukaryotic expression vector containing the bovine follistatin cDNA sequence.【Methods】Total RNA was extracted from bovine ovary by Trizol total RNA Extract Kit,and the whole coding region of bovine follistatin cDNA gene was cloned by RT-PCR using specific primers containing restriction enzyme cutting site.The purified bovine follistatin cDNA was inserted into pMD18-T vector and was then sequenced,then subclone the correct follistatin cDNA to eukaryotic expression vector pIRES-AcGFP.Double-enzyme cleavage and PCR test were used to identify the vector.【Results】Double-enzyme cleavage and PCR test showed that FSTN was successfully cloned into eukaryotic expression vector.【Conclusion】We successfully constructed the eukaryotic expression vector pIRES2-AcGFP1-FSTN.This study provided the foundation for fostering high beef quality transgenic cattle of promoting muscle growth.%[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫贡长慧;冯胜;沈文静;李军【摘要】将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入pET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) pET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有ψ=1％的TritonX-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaC1的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting 方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.【期刊名称】《海南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】7页(P110-116)【关键词】生长抑素疫苗;融合蛋白;原核表达【作者】贡长慧;冯胜;沈文静;李军【作者单位】热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q939.91生长抑素 (Somatostatin, SS)是由垂体分泌的，当体内生长激素过多时，机体会分泌生长抑素来抑制其释放[1].通过接种生长抑素基因工程治疗性疫苗来间接增加体内生长激素的含量，并利用这种治疗方式来治疗疾病，其效果更佳.相较其他化学药与中成药，治疗性疫苗具有特异性高、副作用小、无耐药性、半衰期长等优势[2].目前，许多治疗性疫苗已经上市[3-4]，其主要针对的是如癌症、糖尿病以及自身免疫性疾病等高发疾病[5]，而生长抑素治疗性疫苗却还未上市，尽管如此，其仍然具有极大的应用前景，因为注射该疫苗可以刺激机体产生抗生长抑素抗体，而且在一定时间内，抗体会中和体内的内源性生长抑素，降低其水平，从而使体内生长激素的水平得到提高[6].尽管生长抑素的功能强大，但其分子质量小，免疫原性弱，通常在免疫时都需要将其与免疫佐剂基因进行重组融合才能增强其免疫原性.LTB(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LTB)是大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位，其由5个相同的B亚单位成环状组成，是非常有效的免疫佐剂之一，且不具备毒性，具有良好的免疫佐剂活性[7]，此外，LTB信号序列还能引导人生长激素的分泌表达[8].基于此，本研究将生长抑素与LTB进行基因融合，构建了重组质粒，并将其转化至表达菌株(表达)，结果最终证明，生长抑素融合蛋白可以在大肠杆菌中正确表达，因此本研究为开发新型高效的生长抑素基因工程疫苗奠定了良好的基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒和菌株质粒pET28a和E.coli DH5α菌株由本室保存；BL21(DE3)菌株由齐兴柱老师惠赠.1.1.2 主要试剂限制性核酸内切酶Nco I，BamH I，Not I和T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、卡那霉素(Kan)、质粒DNA纯化试剂盒、蛋白质Marker、DNA marker、羊抗兔HRP-IgG以及抗6×His标签多抗、EL-TMB显色试剂盒等均购自生工生物(上海)有限公司；兔抗SS多抗购自博士德公司；10周龄昆明种雌鼠(SPF级)购自海南省药物研究所，实验动物许可证号为：SCXY(琼)2015-0007；其他试剂均为国产分析纯.1.2 方法1.2.1 原核表达质粒的构建与鉴定设计LTB引物：根据NCBI网站中核酸序列数据库中所提供的LTB基因序列来设计引物(P1：5′-TTACCATGGGCACCGCAGACTATTACAG-3′,P2:5′-GTGGGATCCCTAGTTATTCATACTGATTG-3′)；提取大肠杆菌中的基因组DNA并扩增目的基因，同时按照细菌基因组DNA试剂盒说明书的方法提取DNA并纯化；根据PCR常规方法，扩增目的基因.继而进行双酶切、连接、制备感受态细胞、转化至E.coli DH5α克隆载体中，然后经Kan抗性筛选和菌落PCR鉴定获得重组子，并送生工生物进行测序验证.设计合成生长抑素(A4030-2)基因的引物，并扩增目的基因，将LTB-pET28a重组质粒双酶切，与生长抑素基因连接，制备感受态细胞，并转化到E.coli DH5α，经Kan抗性筛选和菌落PCR鉴定获得重组子，并测序.测序成功后，提取重组质粒，转化至BL21(DE3)表达菌株中，再经Kan抗性筛选并测序.测序成功后，培养并保种.1.2.2 重组蛋白在BL21(DE3)中的表达与鉴定 1) 优化重组蛋白的发酵时间将A4030-2-LTB/BL21(DE3)接种至含Kan的LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养，过夜，然后取过夜培养液，扩大培养，直到OD600值在0.4～0.6之间，然后在实验组中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于37 ℃振荡培养2，3，4，5，6 h，接着离心，分别回收菌体沉淀，最后通过SDS-PAGE技术检测最佳的发酵时间. 2) 优化重组蛋白的发酵温度将A4030-2-LTB/BL21(DE3)接种至含Kan的LB液体培养基中，并于37 ℃振荡培养，过夜，然后取过夜培养液，扩大培养，直到OD600值在0.4～0.6之间，接着在实验组中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，并分别将其置于16 ℃和37 ℃下培养3小时，然后离心并分别回收菌体沉淀，最后通过SDS-PAGE技术来检测最佳的发酵温度.3) 优化重组蛋白IPTG浓度将A4030-2-LTB/BL21(DE3)接种至含Kan的LB液体培养基中，并于37 ℃振荡培养，过夜，然后取过夜培养液，扩大培养，直到OD600值在0.4～0.6之间，接着在实验组中分别加入终浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1 mmol/L的IPTG，并于37 ℃振荡培养3小时，然后离心并分别回收菌体沉淀，最后通过SDS-PAGE技术来检测最佳的IPTG浓度.4) 优化重组蛋白的洗涤条件在培养菌液的沉淀中加入超声破碎缓冲液，于冰浴条件下超声、离心，然后取沉淀(每克噬菌体沉淀重悬于1 mL水中)，将其分装至1.5 mL的离心管中，每只离心管分装100 μL并于4℃保存.取其中的一只离心管，高速离心10 min，弃上清，取沉淀.实验1：每份沉淀重悬于含不同浓度(1，2，3，4 mol/L)尿素的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)中；实验2：每份沉淀重悬于含不同浓度(2，3mol/L)尿素的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)中、含1%Triton X-100的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液和含1 mol/L NaCl的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液；实验3：每份沉淀重悬于含不同浓度(0.5%，1%，2%)Triton X-100的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和含0.5 mol/L NaCl的0.05 mol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，然后高速离心10 min.上清与每份菌体沉淀均采用SDS-PAGE电泳进行检测，优化最佳洗涤条件.5) 重组蛋白在BL21(DE3)菌中的表达纯化与鉴定在细菌沉淀中加入超声破菌缓冲液，采用细胞超声破碎仪在冰浴条件下超声，然后离心15 min，取沉淀.接着，加入包涵体洗涤缓冲液，重悬沉淀，在冰浴条件下超声5 min.离心15 min，取沉淀，并重复洗涤一次，至沉淀呈乳白色状.将沉淀重悬于5 mL包涵体溶解缓冲液中，电磁温和搅拌、过夜.将溶解好的蛋白质溶液高速离心20 min，然后将上清液于0.45 μm的滤膜过滤，以获得蛋白质溶液，再用亲和层析法纯化蛋白，最后用SDS-PAGE法来分析蛋白的纯化情况，并用Gel-Pro Analyzer4.0进行图像灰度扫描.取纯化样品A4030-2-LTB/BL21(DE3)与A4030-2-LTB/BL21(DE3)对照组，沸水浴5 min后,立即冰浴，然后高速离心15 min，取上清.接着，进行15%SDS-PAGE电泳检测：采用半干法将重组蛋白转印至硝酸纤维素膜上(20 V，30 min)，用1*TBST洗涤膜3次，每次10 min，70 r/min；用含5%脱脂奶粉的1*TBST，室温封闭1 h；加入按1∶1 000比例稀释的抗6*His标签多抗，于4 ℃缓慢震荡(40 r/min)12～16 h；用1*TBST洗涤膜3次，每次10 min，70 r/min；再加入按1∶8 000比例稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,室温孵育1 h；用TBST洗膜3次,每次10 min；最后，用DAB试剂盒显色10 min,一旦出现蛋白带,立即用去离子水终止,同时观察结果，并拍照保存.用上述同种方法，将一抗换做1∶300稀释的兔抗生长抑素多克隆抗体，观察结果并拍照、保存.6) 重组蛋白免疫效果的检测与鉴定将14只雌性昆明小鼠，随机分为两组，每组7只，实验组足底免疫纯化蛋白(1 mg/mL)50 μL，而对照组足底免疫50 μLPBS缓冲液.各组分别于0天、21天、42天进行3次免疫，在第三次免疫的一周后于眼眶静脉丛采血，静置血液4 h，然后以2 500 r/min离心,分离血清,并于-20℃保存.用间接ELISA法检测抗SS抗体滴度，以SS包被酶标板，用优化后的包被液将抗原做适当稀释，优化后包被抗原浓度为10 μg/mL,每孔加100 μL,37 ℃温育4小时，倒尽板孔中液体，加300 μL洗涤液，静置3 min，反复3次，加封闭液100 μL，37 ℃温育1 h，加被检血清，用封闭液稀释到1∶200,1∶400，1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶4 000,1∶5 000,1∶6 000,1∶7 000,1∶8 000，阴性对照亦如此稀释，37 ℃温育1 h，加二抗(稀释为1∶8 000)100 μL，37 ℃温育1 h，加底物100 μL，37 ℃反应20 min，加入终止液50 μL，检测血中抗生长抑素抗体效价.当P/N值≥2.1时判为阳性，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样的吸光值，结果是采用SPSS17.0软件来分析，组间P/N值差异则用t 检验.图1 pET28a-A4030-2-LTB重组质粒的构建图谱2 结果2.1 生长抑素重组质粒的测序鉴定重组质粒pET28a-A4030-2-LTB的结构图如图1所示.经上海生工生物公司测序，根据图2所示，从该测序图谱的峰图可以判断出其序列完全正确，融合基因构建成功.2.2 生长抑素重组蛋白的SDS-PAGE分析2.2.1 生长抑素重组蛋白发酵时间优化的SDS-PAGE分析如图3中所示，对目的条带进行半定量分析，当培养3 h时，蛋白表达量最高. 图2 A4030-2-LTB/BL21(DE3)重组质粒的测序结果图3 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白发酵时间的优化图4 A4030-2-LTB/BL21(DE3) 融合蛋白发酵温度的优化(1—2：发酵温度：16 ℃，37 ℃；3：非诱导蛋白；M：蛋白质标记)2.2.2 生长抑素重组蛋白发酵温度优化的SDS-PAGE分析如图4所示，在37 ℃培养大肠杆菌，其蛋白表达量最高.2.2.3 生长抑素重组蛋白IPTG浓度优化的SDS-PAGE分析从图5中可见，在14.4 kD附近，通过灰度扫描所进行的半定量分析可知，当加入1 mmol/L的IPTG时，蛋白的表达量最高.图5 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白IPTG浓度的优化(1—10分别为IPTG浓度：0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L，0.4mmol/L，0.5 mmol/L，0.6 mmol/L，0.7 mmol/L，0.8 mmol/L，0.9 mmol/L，1 mmol/L; 11:非诱导蛋白; M: 蛋白质标记)图6 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白洗涤液中尿素浓度的优化(1，3，5，7表示：用1 mol/L，2 mol/L，3 mol/L和4 mol/L的尿素缓冲液洗涤包涵体沉淀)2.2.4 生长抑素重组蛋白洗涤条件优化的SDS-PAGE分析用含1，3，4 mol/L尿素的洗涤液洗涤包涵体，离心后的上清都含有目的蛋白(箭头所示)，只有用含2 mol/L尿素的洗涤液洗涤时，离心后的上清不含目的蛋白.如图6所示，使用含2 mol/L尿素的缓冲液洗涤液，其效果最佳.用含2，3 mol/L尿素的洗涤液洗涤包涵体，再次验证，只有用含2 mol/L尿素的洗涤液洗涤时，离心后的上清不含目的蛋白(右箭头所示).用含1 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体后，上清溶液有目的蛋白(左箭头所示)，而用含1%Triton X-100的缓冲液洗涤包涵体则没有将目的蛋白洗涤下来.如图7所示，含2 mol/L尿素的缓冲液可以洗涤包涵体，而含1 mol/L NaCl的缓冲液则不可以洗涤包涵体，但含1%Triton X-100的缓冲液可以洗涤包涵体.图7 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白洗涤液中各成分浓度的优化(1，3表示：用2，3 mol/L的尿素缓冲液洗涤的包涵体沉淀；2，4表示：于离心后洗涤含2，3 mol/L尿素缓冲的上清液；5表示：用1 mol/L的NaCl缓冲液洗涤包涵体沉淀；6表示：于离心后洗涤含1 mol/L NaCl缓冲液的上清液；7表示：用1%triton X-100缓冲液洗涤包涵体沉淀；8表示：于离心后洗涤含1%tritonX-100缓冲液的上清液；9表示：超声后的包涵体沉淀；10表示：非诱导蛋白质；M：蛋白质标记)图8 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白洗涤液中各成分浓度的优化(1表示：以0.5 mol/L NaCl 缓冲液洗涤的包涵体沉淀；2表示：离心后洗涤含0.5 mol/L NaCl缓冲液的上清液；3，5，7表示：以0.5%,1%和2% triton X-100缓冲液洗涤包涵体沉淀；4，6，8表示：离心后洗涤含0.5%,1%和2% triton X-100缓冲液的上清液；9表示：非诱导蛋白质；M：蛋白质标记)用含0.5 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗涤后，上清不含目的蛋白；用含0.5%，1%，2%Triton X-100的洗涤液(pH8.0)洗涤，或以1%Triton X-100洗涤，杂蛋白的含量最高，且不会洗涤出目的蛋白.从图6—8可看出，用含0.5 mol/L NaCl，1%Triton X-100和2 mol/L尿素的缓冲液洗涤后的包涵体，其沉淀最佳.图9 A4030-2-LTB/BL21(DE3)融合蛋白的纯化(1：总细菌溶解液；2：超声后的上清液；3：超声后的沉淀；4：包涵体溶解的上清液；5：纯化蛋白；6：非诱导蛋白质；M：蛋白质标记)2.2.5 生长抑素重组蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析与免疫印迹分析如图9所示，灰度扫描显示目的蛋白纯度达90%以上.左图是抗6*His标签多抗作为一抗，右图是兔抗生长抑素多克隆抗体作为一抗.图10结果表明，在15 kD附近有一条明显的杂交带出现, 与目标蛋白的分子质量大小完全吻合, 这表明重组质粒可以在重组菌中稳定表达, 且表达产物具有特异免疫活性.2.2.6 重组蛋白免疫小鼠血清中抗体水平的检测对重组蛋白免疫小鼠的检测结果为：P/N值显著高于对照组的P/N值，实验组的抗体阳性率为85.7%；对照组则无抗体阳性鼠.图10 重组蛋白表达产物免疫印迹图(1：以Anti-6*His抗体温育的蛋白质；2：非诱导蛋白质；3：以Anti-SS抗体温育的蛋白质；4：非诱导蛋白质)表1 免疫小鼠7周后血清中抗生长抑素抗体的P/N值及抗体阳性率组样品平均值阳性比处理组72.206 3±0.020 4**85.7对照组70.856 1±0.022 80注：“**”表示P<0.01.3 讨论目前，治疗性疫苗还存在诸多安全性问题[9-12]，首先是靶标的选择，靶标是否有效，很多疫苗的作用机制尚不清楚，到底能否通过调节靶标生理功能来治疗疾病也还未可知；再者，有些疫苗的作用靶标遍布全身，副作用明显.其次，免疫原性弱也是一大问题，比如单用多肽疫苗，由于其易被体内的肽酶降解，因而其药效大大降低[13]，因此，如何提高免疫原性也是亟待解决的问题.生长激素制剂在临床使用中有两大弊端：一是在临床中需要频繁注射生长激素，二是注射生长激素后，在体内会产生抗体，从而影响药效.而用生长抑素疫苗来代替生长激素，不仅能减少注射次数，降低医源性损伤的风险；而且此类疫苗所产生的抗体能够中和体内的生长抑素，间接地使内源性生长激素增加，如此更能有效地作用于机体，从而促进机体的生长发育.因此，本实验研究的生长抑素疫苗对于解决此类问题有着十分重要的意义.生长抑素疫苗能促进动物的生长发育，然而某些时候，它也能促进动物减重.Haffer[14]将生长抑素疫苗腹腔免疫小鼠，其免疫效果显著，使肥胖型小鼠体重降低.Johansen等人[15]用外源性生长激素治疗肥胖模型动物时发现其具有降低体重的药理效应.Vickers等人[16-17]在大鼠模型中应用生长激素时发现其能加速体内的脂肪分解,具有降低高血压和改善心血管功能的作用.因此，未来我们可以将此疫苗应用于肥胖症的治疗中，这为治疗肥胖症提供了新思路，这也是本实验研究的重点，对于此，目前国内还未有人做过.本实验将LTB基因与生长抑素基因进行融合是为了增强疫苗免疫原性，Zhang等人[18]将 LTB 基因与禽流感病毒中的M2蛋白基因融合，表达了具有免疫活性的蛋白质.在通过口服方式对小鼠进行免疫时发现，LTB 能显著提高小鼠对抗原的免疫应答.Rask等人[19]通过化学方式将人血丙种球蛋白与LTB进行耦合来免疫小鼠，结果抗原与粘膜结合分子LTB 的耦合物可以显著地提高其免疫原性.在本研究中，当我们把目的基因和LTB基因进行融合，然后将其转入到pET28a质粒表达载体中后，获得了正确的重组质粒.pET28a质粒具有强启动子、核糖体结合位点(RBS)、基因标签等，其在多个酶切位点后具有His标签，因此，可将融合基因与His标签相融合，如此，便于目的蛋白质进行亲和层析分离[20].但在实验过程中，纯化的蛋白质溶液仍存在杂蛋白，因为除了含His标签的目的蛋白会特异性地吸附亲和层析柱外，仍然会有因分子的错误认别和分子间非选择性作用力而吸附一些杂蛋白的现象，而且在洗脱过程中，配体分子会不可避免地脱落进入分离体系中.所以，为解决此类问题，在包涵体洗涤过程中尽可能地除去杂蛋白，这不失为一种方法，本实验通过优化洗涤条件来纯化蛋白质，所得结果确实比以往实验中的结果要好得多，而且融合蛋白可以在宿主菌中稳定表达,并且表达产物具有免疫活性.4 结论本研究结果表明，将LTB基因与生长抑素基因融合，可构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB，并可将其转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,从而获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pET28a-A4030-2-LTB，进而用其表达出重组蛋白(纯度达90%).使用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可优化发酵条件和包涵体洗涤条件，在37 ℃，当加入1 mmol/L的IPTG并培养3 h时其表达的蛋白量最多，使用含1%TritonX-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀，其效果最佳.采用Western Blotting技术可检测到该蛋白具有免疫原性，并在该蛋白免疫小鼠上可以检测到抗生长抑素抗体,而且处理组小鼠与空白组小鼠的差异显著.由此认为，该蛋白免疫动物具有很大的应用前景,但其安全性还有待进一步研究，此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.【相关文献】[1] 胡智铧. 奥曲肽在TSH腺瘤术前治疗使用的作用[J]. 饮食保健, 2017, 4(6).[2] 李新颖. Anti-HER3抗体抑制Herceptin耐药及功能优化研究[D]. 北京: 中国人民解放军军事医学科学院, 2016.[3] Akbar S M, Al-Mahtab M, Uddin M H, et al. HBsAg,HBcAg,and combinedHBsAg/HBcAg-based therapeutic vaccines in treating chronic hepatitis B virus infection[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International, 2013, 12(4): 363-369.[4] Keijzer C, Zee R V D, Eden W V, et al. Treg inducing adjuvants for therapeutic vaccination against chronic inflammatory diseases[J]. Frontiers in Immunology, 2013, 4(4): 1-10.[5] 曹王丽, 王如伟, 方玲, 等. 治疗性疫苗国内外研发现状与发展趋势[J]. 安徽农业科学, 2013, 36: 13 917-13 919.[6] 梁爱心, 冯细钢, 韩丽, 等. 新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定[J]. 生物工程学报, 2008, 24(6): 995-998.[7] 张国广, 罗茂春, 董艳美, 等. LTB的表达及其粘膜免疫佐剂活性分析[J]. 厦门大学学报(自然科学版), 2012, 51(5): 918-922.[8] Ghorpade A, Garg L C. Efficient processing and export of human growth hormone by heat labile enterotoxin chain B signal sequence[J]. Febs Letters, 1993, 330(1): 61-65.[9] 杨富强, 饶桂荣. 乙型肝炎治疗性疫苗研究进展[J]. 传染病信息, 2015, 28(2): 65-69.[10] 余化平, 徐燕梅, 罗远林, 等. 治疗性肿瘤疫苗的研究进展[J]. 中国疗养医学, 2015, 24(10): 1 038-1 042.[11] 王卡娜, 郄明蓉. HPV治疗性疫苗研究现状[J]. 实用妇产科杂志, 2017, 33(2): 89-91.[12] 闻玉梅. 对发展乙型肝炎预防性与治疗性疫苗的思考与建议[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2013, 33(1):1-2.[13] 欧霞, 孙茂盛, 李鸿钧. 治疗性疫苗的研究进展[J]. 医学综述, 2012, 18(17): 2 844-2 846.[14] Haffer K N. Effects of novel vaccines on weight loss in diet-induced-obese(DIO) mice[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2012, 3(3): 1-7.[15] Johansen T, Malmlöf K. Treatment of obesity using GH[J]. Metabolic Syndrome & Related Disorders, 2006, 4(1): 57-69.[16] Franco C, Bengtsson B A, Johannsson G. The GH/IGF-1 axis in obesity:physiological and pathological aspects[J]. Metabolic Syndrome & Related Disorders, 2006, 4(1): 51-56.[17] Vickers M H, Ikenasio B A, Breier B H. Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesity induced by an adverse prenatal environment[J]. Journal of Endocrinology, 2002, 175(3): 615-623.[18] Zhang G G, Li D X, Zhang H H, et al. Enhancement of mucosal immune response against the M2eHBc+ antigen in mice with the fusion expression products of LTB andM2eHBc+ through mucosal immunization route[J]. Veterinary Research Communications, 2009, 33(7): 735-747.[19] Rask C, Fredriksson M, Lindblad M, et al. Mucosal and systemic antibody responses after peroral or intranasal immunization:effects of conjugation to enterotoxin B subunits and/or of co-administration with free toxin as adjuvant[J]. Apmis, 2000, 108(3): 178-186.[20] 朱旭芬. 基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社, 2010: 295-296.。