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里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究

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第29卷第6期2009年12月林　产　化　学　与　工　业Che m istry and I ndustry of Forest Pr oducts Vol .29No .6Dec .2009里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究 收稿日期:2009-06-17 基金项目:国家高技术研究发展计划(2008AA05Z401);江苏高校自然科学重大基础研究项目(06KJA22015);江苏省高技术计划(BG2005327) 作者简介:方浩(1985-),男,江苏江阴人,硕士生,主要从事生物燃料乙醇研究工作　3通讯作者:宋向阳(1965-),男,副教授,博士,研究方向为生物化工;E 2ma il:xiangyangs ong@hot m ail .com 。

F ANG Hao 方浩,宋向阳3,赵晨,常铮,储洁,勇强(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏南京210037)摘　要:　研究了利用里氏木霉和黑曲霉混合培养的形式产纤维素酶,以两个菌种的不同接种比和延迟黑曲霉的接种时间来寻找两个菌种发挥最大协同作用的结合点。

以农林废弃物之一的玉米秸秆为底物,经过蒸汽爆破预处理后,用作产酶碳源。

以里氏木霉单一培养与黑曲霉单一培养为参照进行对比研究。

结果表明,黑曲霉接种较里氏木霉延迟48h,里氏木霉与黑曲霉接种量比为5∶1时,滤纸酶活最高,达3.295I U /mL,高于里氏木霉单一培养(2.480I U /mL ),β-葡萄糖苷酶活达1.010I U /mL,也远远高于里氏木霉单一培养(0.243I U /mL )。

本实验充分证明里氏木霉与黑曲霉混合培养产酶是可行的,并优于单一菌种培养。

关键词:　玉米秸秆;里氏木霉;黑曲霉;混合培养;纤维素酶中图分类号:T Q351;T Q92 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2009)06-0015-05Cellulase Pr oducti on fr o m Mixed Fer mentati on of Trichoder m a reeseiRUT C 230and Apsergillus niger NL02F ANG Hao,S ONG Xiang 2yang,ZHAO Chen,CHANG Zheng,CHU J ie,Y ONG Q iang(Key Laborat ory of Forest Genectics &B i otechnol ogy,M inistry of Educati on,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China )Abstract:Cellulase p r oducti on fr om m ixed fer mentati on of Trichoder m a reesei and A spergillus niger was investigated .The balance point of the t w o strains was established by delaying inoculati on ti m e of A.niger and using different inoculu m rati os .The ti m e courses of cellulase p r oducti on by monoculture of T .reesei and A.niger were used as contr ols .It was f ound that the highest filter paper activity (FP A ),3.295I U /mL,was obtained when delay in A.niger inoculati on was 48h and volu metric inoculu m rati o of T .reesei versus A.niger was 5∶1,higher than the FP A of the monoculture of T .reesei ,2.480I U /mL.The β2glucosidase activity (β2G A )als o increased fr om 0.243I U /mL of the monoculture of T .reesei t o 1.010I U /mL of the m ixed culture aforementi oned .It was de monstrated that the m ixed fer mentati on of T .reesei and A.niger was feasible and superi or t o the monoculture of T .reesei orA.niger .Key words:corn st over;T .reesei ;A.niger ;m ixed culture;cellulase大规模使用纤维素酶降解纤维素的困难是:纤维素酶酶活低、生产成本高。

这是制约纤维素燃料乙醇工业的瓶颈之一。

能够生产纤维素酶的微生物有很多,研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属等等,目前应用最广、研究最深入的纤维素酶生产菌株大多是里氏木霉(Trichoder m a reesei )的优良突变株。

其中里氏木霉RUT C-30被认为是最好的纤维素酶产生菌之一,也是植物纤维原料生物转化制取乙醇工艺中最有工业应用前景的微生物[1]。

里氏木霉菌株虽然能产生高活力的内切型和外切型葡聚糖酶,但是所产的β-葡萄糖苷酶的活力比较低,分解纤维二糖的能力不够强[2-3]。

黑曲霉(A sperg illus niger )是优良的β-葡萄糖苷酶生产菌株[4],通过加入产自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶,或者通过使用里氏木霉和黑曲霉共同培养[5],可以有效地缓解纤维素酶降解纤维素过程中因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制16　林　产　化　学　与　工　业第29卷现象。

由于里氏木霉产β-葡萄糖苷酶的能力较弱,而曲霉属产β-葡萄糖苷酶的能力较强,已经有研究发现可以通过两菌种的混合发酵提高纤维素酶的活力或优化纤维素酶的组分,但这方面的研究还较少。

由于价格低廉、储量丰富和可再生性,玉米秸秆和麦秆等木质纤维素原料以及其它能源作物是生物乙醇工业理想的原料[6]。

蒸汽爆破可以使木质纤维素原料中的半纤维素降解、降低原料的尺寸并提高其比表面积,利于后续纤维素酶催化水解,是具有工业化应用前景的预处理方式。

本实验的目的是研究里氏木霉RUT C-30和黑曲霉NL02混合液态摇瓶发酵,以蒸汽爆破预处理过的玉米秸秆为底物,产纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的情况。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　微生物　里氏木霉(T.reesei)RUT C-30,黑曲霉(A.niger)NL02,由南京林业大学生物化工研究所保藏。

1.1.2　培养基　菌种保藏斜面培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(P DA)。

Mandels[7]菌丝体培养液配方:葡萄糖10g/L,蛋白胨1g/L,Mandels营养盐浓液5mL/瓶,Mandels 微量元素浓液0.05mL/瓶,1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶,T ween802滴/瓶,以上溶液定容至50mL。

产纤维素酶培养基(g/L):葡萄糖1,蒸汽爆破渣30(绝干),(NH4)2S O4　2.2,尿素0.5,蛋白胨1,KH2P O4　2,CaCl2　0.3,MgS O4　0.08,硫酸亚铁0.005,硫酸锰0.0016,硫酸锌0.0014,氯化钴0.0037, T ween802滴,初始pH值4.8,装液量50mL。

1.1.3　原料　蒸汽爆破玉米秸秆,秸秆产自内蒙古呼和浩特市,风干储存。

预处理方式,蒸汽爆破,维持压力1.6MPa,维压时间7m in。

蒸汽爆破渣用蒸馏水洗至中性,保存于4℃冰箱中,平衡水分。

1.1.4　主要试剂　3,5-二硝基水杨酸(DNS),柠檬酸缓冲液(1mol/L、0.05mol/L),Mandels营养盐浓液,Mandels微量元素浓液,T ween80,pNPG溶液,1mol/L Na2CO3溶液。

1.2　实验方法产酶方法:活化完毕后的里氏木霉、黑曲霉菌液,以黑曲霉推迟接入0(同时接入)、24、48h和里氏木霉与黑曲霉接种体积比1∶1、5∶1所产生的6种组合形式(0h:1∶1、5∶1;24h:1∶1、5∶1;48h:1∶1、5∶1)接入产酶培养基,第1天30℃,第2天开始28℃。

从第2天开始每天取样,在3000r/m in、4℃条件下离心10m in,取上清液(粗酶液)测定滤纸酶活力(FP A)和β-葡萄糖苷酶活力(β-G A),同时测定3个平行样,取平均值。

1.3　分析方法1.3.1　FP A和β-G A的测定方法　采用国际理论和应用化学协会(I U P AC)推荐的标准方法[8]测定。

一个滤纸酶活力的国际单位(I U)定义为:在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

一个β-葡萄糖苷酶酶活力(I U)单位定义为:每分钟水解生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。

1.3.2　总还原糖含量的测定　用DNS法测定。

1.3.3　糖组分含量测定　用HP LC测定。

色谱仪,Agilent1100型高效液相色谱仪;色谱柱,B i o-Rad Am inex HPX-87H(300mm×7.8mm);柱温,55℃;流动相为脱气高纯水;流速0.6mL/m in;检测器,示差折光检测器(R I);进样量10μL。

1.3.4　pH值的测定　用Hanna公司酸度计测定。

2　结果与讨论2.1　里氏木霉产酶历程产酶历程开始后,FP A在3d后开始迅速增加,在第5天达到最大值,为2.480I U/mL,随后由于pH值剧烈变化等环境因素的影响,纤维素酶迅速失活(见图1(a))。

导致纤维素酶失活的原因还可能来自里氏第6期方浩,等:里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究17　木霉细胞破碎自溶时所产生的大量蛋白质水解酶。

β-G A 在第4天开始明显增加,第6天达到最大值,为0.389I U /mL 。

β-G A 增长滞后一天,主要是因为体系中的初始β-G A 很低。

里氏木霉产的胞外纤维素酶催化水解底物生成了较多的纤维二糖,纤维二糖在体系中积累,而纤维二糖具有诱导合成β-葡萄糖苷酶的作用。

里氏木霉产β-葡萄糖苷酶的能力较低,使得其所产的纤维素酶酶系结构不合理。

在里氏木霉RUT C-30产纤维素酶的液态培养基中,需加入T ween 80等表面活性剂以抑制菌丝球的形成,提高里氏木霉分泌胞外蛋白的能力[9]。

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纤维素酶的发酵生产实验报告

纤维素酶的发酵生产实验报告

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验一、实验目的1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。

高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。

纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。

以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。

还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。

三、材料与试剂配制1、生产菌种：黑曲霉2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。

3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl = 0.7 g/L ; NaH2PO4= 2.0 g/ L ;Na2HPO4=3.0 g/ L ,pH7.4。

4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，CoCl22.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。

5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。

6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水12 ml（含1%微量元素液，1%氯化铵或硫酸铵，0.05%蛋白胨），自然pH值。

7、6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，20.8gNaOH,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。

一株里氏木霉产纤维素酶发酵条件的研究

一株里氏木霉产纤维素酶发酵条件的研究


酶活力(U/ml)
140
Cx
C1Cx
120
C1
100
80
60
40
20
0 60
80 100 120 140 160 培养时间(h)
图 1 培养时间对产酶的影响 Effects of fermentation time on cellulase production
从图 1 可以看出，Cx 酶活力高于 C1 酶活力，培养 初期酶活力随着培养时间的延长而增强，Cx 酶在 96h 时 达到最大值，C1 酶在 120h 达到最大值，发酵后期它们 的活力逐渐降低。 2.2 麸皮含量对产酶的影响
376 2008, Vol. 29, No. 11
食品科学
※生物工程
1.2.1 酶底物反应液 1% 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)醋酸缓冲液(pH4.8)，
0.5% 微晶纤维素(MCC)- 醋酸缓冲液(pH4.8)，1% 水杨素 醋酸缓冲溶液(pH4.8)。
1.2.2 DNS 试剂配制 溶液 A，溶解 6.9g 结晶酚于 15.2ml 10% NaOH 中，
通过测定发现[13]，每升麸皮培养基含还原糖 4.67g、 总氮 2.17g、蛋白质 0.26g、灰分 0.76g, 表明麸皮培养基 中含有微生物生长所需要的碳源、氮源、多种矿物质 等营养物质，碳氮比协调。表 1 为摇瓶中不同的麸皮 添加量对里氏木霉产酶的影响。
※生物工程
食品科学
2008, Vol. 29, No.11 377
菌株在不同的氮源下，其生存能力不同，因此产 酶能力也不同，选择适合的氮源对菌株的产酶能力有重 要的影响。通过实验改变产酶培养基氮源的种类，选 择一些有机氮源和无机氮源研究其对产酶的影响，结果 见表 2 。
双菌混合发酵产蛋白酶条件的研究

双菌混合发酵产蛋白酶条件的研究


较 混茵培养对产 酶活性 的影 响。试验发现 ，在 ４ ０ ￣ Ｃ－ Ｆ ￣ ￣ 茵发 酵所 产酶活力 比单 茵发 酵所产酶 活力高 ４ ． ８ Ｕ／ ｍ Ｌ ，装液 量为 ５ ０ ｍ Ｌ时混 茵的酶活高出单茵的酶活 ５ ． １ Ｕ／ ｍ Ｌ 。试验表 明木 霉与黑曲霉混合 培养产酶是 可行的 ，并优 于单一茵种培 养。
［ ３ 】 宋娜 娜 ， 宋 向阳 ， 欧 阳嘉等 ． 里 氏木 霉 与黑 曲霉 混合发 酵产纤 维素 酶及其水解特 性 【 Ｊ ］ ． 生物加 工过程 ， ２ ０ １ ０ ， ８（ ５ ） ： ５ — １ Ｏ ． ［ ４ ］ 蒋 宗勇 ． 饲用酶 制剂 生产及 其在 动物饲料 中的应用 【 Ｊ ］ ． 饲料工 业， １ ９ ９ ２ ， １ ３（ ８ ） ： ７ — ９ １ ． ［ ５ 】 肖竞 ， 李卫芬 ． 酸性蛋 白酶及 其在 畜牧 业中 的应用 啪． 营养研 究，
（ ８）： ５ ０ ～ ５ ９ ．
７ ０ ｍ Ｌ 的单菌和双菌液体发酵培养基。取活化好的黑曲霉和木 ［ ２ 】 胡学 志 ， 王俊 ． 蛋 白酶 生产和 应用 的进展 ［ Ｊ 】 ． 工业微 生 物，２ ０ ０ ８ ，
霉种子液等 比例接种到培养基 中，４ ０ ￣ Ｃ 摇床培养 。 １ ． ７蛋 白酶活力测定 取适 当稀释 的粗酶液 Ｉ ｍＬ ，在 ３ ７ ℃水浴 中预热 ２ ｍ ｉ ｎ ，再 加 入 同样 预 热 的 ２ ％酪蛋白 ｌ ｍ Ｌ ，保 温 １ ０ ｍ ｉ ｎ 后 沸水 浴 ７ ｍ ｉ ｎ 终止反应 ， 继续在 ３ ７ Ｃ 水浴 中保温 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 使沉淀完全 ， 过滤 ， 取滤 液 ｌ ｍＬ ，加入福 林 Ａ液 ５ ｍＬ与 福林 Ｂ液 Ｉ ｍ Ｌ，３ ７ ℃下反 应２ ０ ａｉ ｒ ｎ ，在 ６ ８ ０ ｎ ｍ下测定光密度值 。以先进行灭活后加酪蛋 白沉淀过滤 的酶液 ，作为空 白对 照。 蛋 白酶酶 活定 义为 ：３ ７ ￣ Ｃ 条件下 ，每分钟水解酪蛋 白产生
年产300吨纤维素酶工厂的初步设计_毕业设计

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计_毕业设计

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计摘要纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半。

目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还会造成环境污染。

利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。

本设计采用目前认为是最好的产纤维素酶的菌种里氏木霉作为发酵菌种，液体深层发酵过程中采用变温发酵的方法分别控制菌种的生长和产酶，提取过程中采用超滤、层析等，提高产品的收率。

最后采用喷雾干燥做成固态的酶制剂。

本设计的主要内容有：工厂总平面布置、全厂工艺流程设计、工艺计算、设备的计算与选型、成本核算；另外，完成设计图纸8张，有工厂总平面布置图、工艺流程图（3张）、发酵罐设计图、种子罐设计图、发酵车间设备布置图（平面图和立面图）。

根据全厂工艺设计和计算结果可以看出，该设计能够达到工业生产的要求。

关键词：纤维素酶；液体深层发酵；里氏木霉ABSTRACTCellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on.This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring .The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory，the calculation of the craft，the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can come up to the request of industrialization.Keywords: Cellulase; liquid submerged fermentation;; Trichoderma reesei目录1 绪论11.1纤维素酶简介11.2纤维素酶的研究状况 11.2.1国外研究概况 (2)1.2.2国内研究概况 (3)1.3 纤维素酶的应用 41.3.1 纤维素酶在果实和蔬菜加工上的应用 (4)1.3.2 纤维素酶在酱油酿造上的应用 (4)1.3.3 纤维素酶在酒精发酵中的应用 (5)1.3.4纤维素酶在饲料上的应用 (5)1.3.5在麻棉混纺织物后整理中的应用 (6)1.3.6其它 (6)1.4纤维素酶的发展前景 61.5纤维素酶的生产61.5.1固体发酵生产纤维素酶 (6)1.5.2液体深层发酵生产纤维素酶 (7)1.5.3固定化酶和细胞 (9)1.6目前国内的有关情况 91.6.1国内的需求情况 (9)1.6.2主要技术指标 (9)1.6.3国内几大生产厂家 (10)1.7本设计的目的和内容 101.7.1本设计的目的 (10)1.7.2本设计的主要内容 (10)2 全厂工艺流程及论证122.1无菌空气工艺论证122.1.1无菌空气制备系统工段工艺论证 (12)2.2发酵工段工艺论证132.2.1发酵工艺流程 (13)2.2.2菌种选取 (13)2.2.3培养基 (14)2.2.4生产方法 (14)2.2.5发酵过程的控制 (14)2.3后提取工段工艺论证 152.3.1后提取工艺流程 (15)2.3.2提取方法论证 (15)3 纤维素酶的工艺计算183.1物料衡算183.1.1工艺指标 (18)3.1.3提取工段的物料衡算 (19)3.2热量衡算203.2.1蒸气消耗计算 (20)3.3水平衡计算223.3.1种子罐冷却水 (22)3.3.2发酵罐冷却水 (22)3.4无菌空气衡算223.4.1发酵罐通风量的计算 (22)3.4.2种子培养基等其他无菌空气耗量 (22)3.4.3发酵车间高峰无菌空气消耗量： (22)3.4.4发酵车间年用气量： (22)4 纤维素酶发酵工段的设备选型与计算244.1发酵罐设备选型与计算244.1.1发酵罐的选型 (24)4.1.2生产能力、数量和容积的确定 (24)4.1.3发酵罐基本尺寸确定 (24)4.1.4冷却面积的计算 (25)4.1.5蛇管设计 (27)4.1.6壁厚计算 (29)4.1.7搅拌器计算 (29)4.1.8搅拌轴功率计算 (30)4.1.9接管设计 (32)4.1.10传动装置设计 (33)4.1.11发酵罐支座选择 (33)4.2种子罐的设备选型与计算334.2.1种子罐的选型 (33)4.2.2种子罐容积和数量确定 (33)4.2.3主要尺寸确定 (34)4.2.4冷却面积的计算 (34)4.2.5设备材料选择 (35)4.2.6壁厚计算 (35)4.2.7种子罐内部结构的工艺计算 (36)4.2.8支座选型 (38)4.3空气过滤器设备选型与计算384.3.1种子罐分过滤器 (38)4.3.2发酵罐分过滤器 (39)4.4无菌空气制备工艺设备选型与计算404.4.1工艺流程 (40)4.4.2空气状态的确定 (41)4.4.4储罐 (41)4.4.5一级冷却装置 (42)4.4.6旋风分离器 (47)4.4.8丝网除雾器 (50)4.4.9加热器 (50)4.4.10总过滤器 (52)4.5提取工段设备计算及选型534.5.1提取工段工艺流程 (53)4.5.2提取工段设备选型 (53)5 全厂布置的说明 555.1工厂总平面布置555.1.1总平面布置依据 (55)5.1.2.布置原则： (55)5.1.3布置说明 (55)5.1.4车间布置设计 (56)5.1.5设计遵循的原则： (56)5.1.6本设计的车间布置说明 (58)6 经济核算606.1投资估算606.1.1设备投资 (60)6.1.2土建投资 (60)6.1.3全厂总投资 (61)6.2成本计算616.2.1主要成本计算 (61)6.2.2煤耗 (61)6.2.3水、电耗 (61)6.2.4折旧费及其他费用 (62)6.2.5全厂人员安排 (62)6.2.6全厂每年销售成本 (62)6.2.6全年净收入 (63)7 结论64参考文献65附录68英语翻译76英文原文76中文译文841 绪论1.1纤维素酶简介纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物,是地球上最为丰富的可再生性天然资源。