下载文档原格式
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4426-443丨页研究报告Research Report基于实时荧光P C R方法的牦牛肉源性成分鉴别郭华麟1明玥1李轲2时淄航1尤祯丹u蒋玉涵陈传君徐超2韩国全y1四川农业大学食品学院，雅安,625014; 2郑州海关检验检疫技术中心，郑州,450003; 3四川农业大学食品加工与安全研究所，雅安，625014* 通信作者，*********************.cn摘要为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法,本研宄基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物 的C y A基因序列差异，设计其特异性引物。
特异性实验结果表明，猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发 生交叉反应；灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/jxL;抗干扰实验结果表明，当牦牛肉的添加量 为1%时仍可检出；对市场上的20份不同种肉样进行检测，除牦牛肉样品检测结果呈现阳性外，其余肉样均 为阴性。
本实验所建立的实时荧光PCR方法为牦牛源性成分鉴别提供一种快速、准确、专属性强的检测方法。
关键词实时荧光PCR,牦牛肉，鉴别Identification of Yak Beef Origin Components Based on Real-time PCRGuo Hualin 1Ming Yue 1Li Ke2Shi Zihang1You Zhendan 1,3Jiang Yuhan u Chen Chuanjun u Xu Chao2Han Guoquan1Food Science College of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014; 2 Zhengzhou Customs of the People's Republic of China, Zhengzhou, 450003; 3 Institute of Food Processing and Safety of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014*Correspondingauthor,*********************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.004426Abstract In order to establish a real-time PCR method for detection of yak beef origin,the specific primers are designed based on comparing the sequence differences of Cytb gene between yak cattle,chickens,pigs,sheep,and duck.Specificity test shows that the DNA of pork,chicken and yellow beef do not have a cross react with the primers;sensitivity test shows that the minimum detection limit of the method is 0.004 ng/jxL;anti-interference experiment shows that it can still be detected when the addition of yak is 1%. 20 different meat samples on the market are tested.Except yak meat samples show positive results,other meat samples are negative.The real-time PCR method established in this experiment provides a rapid,accurate and specific detection method for identification of y ak derived components.Keywords Real-time PCR,Yak,Identification牦牛肉的蛋白质含量丰富，营养成分优于其他 种类的牛肉，作为一种优质肉类而广受消费者喜爱 (邱翔等，2010; Doosti et al.，2014; Iwobi et al.,2015)。
附件4食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法BJS 2019041 范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。
本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。
注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。
2原理提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR 扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。
所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
3.1检测用引物和探针(a) 猪cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’(b) 驴nad5基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’(c) 山羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’(d) 绵羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’探针：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’(e) 牦牛cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’探针：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’(f) 鼠cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’探针：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’3.2 CTAB裂解液：2% (w/v) CTAB，1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20 min，备用。
利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分陆俊贤;唐修君;樊艳凤;贾晓旭;葛庆联;顾荣;王珏;高玉时【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)010【摘要】以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度.结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分.【总页数】4页(P110-112,172)【作者】陆俊贤;唐修君;樊艳凤;贾晓旭;葛庆联;顾荣;王珏;高玉时【作者单位】中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125;中国农业科学院家禽研究所,农业部家禽品质监督检验测试中心,江苏扬州225125【正文语种】中文【相关文献】1.利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究 [J], 张晶鑫;高玉时;樊艳凤;唐修君;贾晓旭;顾荣;陆俊贤2.实时荧光定量PCR鉴别食品中猪源性成分的研究进展 [J], 高琳3.实时荧光定量 PCR 检测畜禽肉制品中鸭源性成分 [J], 林彦星;花群义;曹琛福;张彩虹;阮周曦;刘建利;宗卉;廖立珊;孙洁;杨俊兴;吕建强4.基于锁式探针的荧光定量PCR技术快速检测肉制品中鸭源性成分 [J], 满岳[1];王溪桥[1];周小平[1];Nazariyah Yahaya[2];丁功涛[3];李冰[4]5.利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究 [J], 张晶鑫;樊艳凤;唐修君;贾晓旭;高玉时;顾荣;陆俊贤;王珏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
ICS67.050B23天津DB12市地方标 准DB12/T 652—2016转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品 种定性检测实时荧光P C R法Detection of genetically modified plants and derived products—Qualitative PCR method for herbicide-resistant soybean DAS-68416-4 and its derivates2016-09-27 发布2016-11-01 实施天津市市场和质量监督管理委员会发布,> t,—*_刖言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由天津市农村工作委员会提出。
本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天 津市东丽区产品质量监督检验所。
本标准主要起草人：兰青阔、李亮、赵新、刘雪岩、宛煜嵩、王成、陈锐、朱珠、刘娜、徐石勇。
本标准2016年9月首次发布。
转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测实时荧光P C R法i范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性的定性PCR检测方法的术语和定 义、检测方法、结果分析与表述。
本标准适用于转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种，以及制品中DAS-68416-4转化体 成分的定性PCR检测。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部1485号公告一4一2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告一8—2013转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR法 农业部2031号公告一 19一2013转基因植物及其产品检测抽样NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求3术语和定义农业部2031号公告一8—2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究作者：张晶鑫樊艳凤唐修君贾晓旭高玉时顾荣陆俊贤王珏来源：《湖北农业科学》2016年第15期摘要：为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法，以线粒体16S rRNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物，以常见畜禽肉（包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等）DNA为模板，进行PCR扩增和特异性检测。
结果表明，筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测，方便简洁，可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。
关键词：禽源性成分；16S rRNA基因；PCR；鉴别中图分类号：TS251.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）15-4021-03DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.15.056Abstract： In order to establish a quick and specific peculiar method， which could identify the components of poultry origin. 16S rRNA gene sequence was use as target site， the specific primers of chicken， pigeon meat and quail meat were designed. The DNA of common livestock and poultry meat including mutton， beef， pork， rabbit meat， pigeon meat， quail meat， chicken， duck and goose were used as template. Though PCR amplification and specific detection， a quick determination method was established to identify the components of poultry origin. The results showed that the selected primer could identify the components of animal origin effectively and quickly. The method was convenient and concise， and could detect the chicken origin， pigeon origin and quail origin in poultry food quickly and accurately.Key words： components of poultry origin；16S rRNA gene；PCR；identification肉与肉制品掺杂、掺假是目前食品质量控制面临的重要挑战。
动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立
邵碧英;陈文炳;郑腾;江树勋;张志灯;李寿崧
【期刊名称】《畜牧与兽医》
【年(卷),期】2004(36)3
【摘要】以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。
应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。
试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。
【总页数】3页(P7-9)
【关键词】动物产品;牛源性成分;羊源性成分;多重PCR;检测方法;动物性食品安全;饲料安全
【作者】邵碧英;陈文炳;郑腾;江树勋;张志灯;李寿崧
【作者单位】福建出入境检验检疫局
【正文语种】中文
【中图分类】S859.84
【相关文献】
1.动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立 [J], 赵冉
2.应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分 [J], 宗卉;范万红;温燕辉
3.动物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR检测 [J], 邵碧英;张体银;李志方;郑腾;陈文炳
4.饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测 [J], 邵碧英;陈文炳;杨婕
5.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化 [J], 邵碧英;张体银;杨婕;陈文炳;郑腾
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量作者：谭波杨春萍刘小玲来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。
以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因，LcoR为内参基因分别合成引物及探针，优化反应条件，评价该方法的特异性和灵敏度。
采用实时荧光PCR相对定量法，以△Ct值与2△△Ct值线性模型分别建立回归曲线，通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。
结果表明：目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增，具有特异性，对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL-1。
以△Ct值与2△△Ct值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7（R2= 0.998）、y=0.712 2x+3.050 4（R2=0.988 7）。
两个方法检测35%～90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%～102.52%、98.55%～106.30%。
将两种定量方法进行数均处理，回收率的偏差减少。
本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性，并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析，对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。
关键词：肉制品；牛源性成分；实时荧光定量PCR；相对定量中图分类号：TS 251.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0006-09DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.002Detection of the Bovine-derived Materials and Their Contents inMeat Products by Real-time Fluorescence Quantitative PCRTAN Bo1，2， YANG Chun-ping3， LIU Xiao-ling1*（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004， China;2. Guizhou Research and Application Center of Detection Technology， Guiyang， Guizhou 550014， China;3. Guizhou Institute of Analysis and Testing， Guiyang， Guizhou 550014， China）Abstract： In order to establish a rapid， efficient， accurate and low-cost method for the identification and quantitative detection of the bovine-derived materials in meat products， the primers and probes were synthesized with the single-copy gene of cell nucleus， bosPDE as the target gene and LcoR as the internal reference gene， to optimize the reaction conditions and evaluate the specificity and sensitivity of the method. By using the relative quantitative method of real-time fluorescence PCR， the regression curves were respectively established with the linear model of △Ct value and 2△△Ct value， and the accuracy of the method was evaluated by simulating artificially the mixed beef samples. The results showed that： the bosPDE primer of the target gene only amplified the DNA of beef， which was specific， and the sensitivity of amplification to beef DNA could reach 0.01 ng·μL-1. The regression curves with △Ct value and 2△△Ct value as the quantitative indexes were y=-3.096 5x+8.479 7 （R2=0.998） and y=0.712 2x+3.050 4 （R2=0.988 7）， respectively. The recovery rates of the artificial simulated mixed beef samples with 35%-90% beef content detected by the two methods were 94.30%-102.52% and 98.55%-106.30%， respectively. The deviation of recovery rate was reduced when the number-average treatment was carried out on the two quantitative methods. The real-time fluorescence quantitative PCR method established in this study could accurately characterize the bovine-derived materials in meat products， and could be used for the relative quantitative analysis of beef in the beef adulterated products. It had important reference value for identifying the adulteration of meat products and quantifying the concentrations of components in beef products.Key words： Meat products； Bovine-derived materials； Real-time fluorescence quantitative PCR； Relatively quantitative近年来，随着全球化经济的高速发展，人们的物质需求逐渐提升，各种肉类食品的流通和交易也越来越频繁，这使得一些不法商家为了牟取暴利，以低价肉替代高价肉，导致肉制品掺假事件频繁发生［1-3］。
肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口，由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。
二、编制依据本标准遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则、GB/T6379《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度》第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的方法》。
三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利益，在肉（制）品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉（制）品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。
通过实验室前期大量的调查研究分析，我们发现肉（制）品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍，大部分肉（制）品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。
这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。
但目前，相应的检测鉴定方法标准的缺失，使得检测监测机构对此无标可依，无法可循，难于判断和裁决。
为了规范国内市场流通秩序，保证市场的正当竞争，保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属，制定本检测标准。
四、编制过程《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。
经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。
根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中心在《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。
农业部办公厅关于2016年度种畜禽质量安全监督检验结果的通报文章属性•【制定机关】农业部(已撤销)•【公布日期】2017.07.11•【文号】农办牧〔2017〕36号•【施行日期】2017.07.11•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】畜牧业正文农业部办公厅关于2016年度种畜禽质量安全监督检验结果的通报农办牧〔2017〕36号各省、自治区、直辖市畜牧（农牧、农业）局（厅、委、办），新疆生产建设兵团畜牧兽医局，各有关种畜禽质量监督检验测试中心，各有关种畜禽生产经营企业：《中华人民共和国畜牧法》规定，我部组织开展了2016年种畜禽质量安全监督检验工作，委托具有法定资质的种畜禽质量检验机构，对种牛、种猪精液进行质量抽检，对种猪、肉鸡商品代进行生产性能测定，现将结果通报如下。
依据《牛冷冻精液》（GB 4143-2008）、《种猪常温精液》（GB 23238-2009）、《种猪生产性能测定规程》（NY/T 822-2004）、《长白猪种猪》（GB 22283-2008）、《大约克夏猪种猪》（GB 22284-2008）、《杜洛克猪种猪》（GB 22285-2008）、《肉鸡生产性能测定技术规范》（NY/T 828-2004）、《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》（NY/T 823-2004）和《鸡饲养标准》（NY/T 33-2004），组织抽检了56家企业762头种公牛的冷冻精液产品及74家企业1030头种公猪的常温精液产品，对21家企业送检的653头种公猪进行了生产性能测定，对12家企业的5400只商品代肉鸡进行了生产性能测定。
检测结果表明，种公牛冷冻精液产品、种公猪常温精液产品抽检合格率分别为98.2%、93.1%，较去年分别增加0.1、3个百分点。
种公猪生产性能测定合格率为80.9%，较去年降低了3.1个百分点。
商品代肉鸡孵化性能、生产性能和屠宰性能等相关指标均符合品种标准。
随着人们生活水平的不断提高，越来越多的肉类制品被摆上了餐桌。
为了利益最大化，有不发商贩掺假销售，更有甚者把不可食用动物的肉添加到商品中出售，严重损害消费者利益。
同时，动物源性饲料中违规掺杂禁用成分的情况也很严重。
如果动物源性饲料细菌超标或者违法添加了禁用物质，就有可能使饲养的禽畜生病，甚至导致食用者患病。
为了保障人们的食品安全，保障动物源性饲料的质量安全，对肉类食品及饲料进行动物源性鉴定是非常必要的。
1 动物源性成分检测技术研究进展有资料表明20世纪80年代，国外学者开始研究肉的种属鉴定检测，到目前为止国内外均由很多相关报道。
其中国内外动物源性成分检验方法主要有两种：核酸检测和蛋白质检测。
核酸检测方法主要包括普通PCR、实时荧光PCR、数字PCR、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）、试纸片法、基因芯片检测、膜芯片法、液相芯片法、显微镜法与二代测序等。
每一种检测方法都有各自的特点及优势，可以从不同方面反映材料的真实情况。
在实际检测工作中，由于食品或原材料的加工方法不同，还应根据样品的不同加工方式选择适用的检测方法进行检测。
众多的研究资料表明最为快速准确的方法是PCR方法[1]，其中探针法实时荧光PCR检测的准确性和便捷性在所有的检测方法中最为突出，对检测设备和检测人员的要求也不高，容易掌握。
目前现行有效的检测方法中以实时荧光PCR方法最多。
2 现行动物源性成分检测标准方法目前，我国已发布的现行有效的动物源性成分检测方法主要有：国家标准18项（表1），行业标准35项（表2），地方标准及其他标准20项（表3）。
其中以PCR和实时荧光PCR检测方法为主。
这些标准方法可以检测出不同种类的动物源性成分，适用范围也各不相同，检测人员可以根据需求自主选择。
目前颁布的这些标准方法基本涵盖了常见的动物源性成分，可以检测日常食品及饲料中可能会遇到的肉源性种类。
食品及饲料中动物源性成分检测方法及标准概述□ 刘彦泓 大连市检验检测认证技术服务中心摘 要：本文分析列举目前食品及饲料中动物源性成分的检测方法，探讨目前动物源性检测的研究进展。
![动物源性成分肉类检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/507dc73b80eb6294dc886c52.png)
专利名称：动物源性成分肉类检测方法专利类型：发明专利
发明人：王磊,曾鹏,刘心,原辉,谢洪涛申请号：CN201410423058.7
申请日：20140825
公开号：CN105441531A
公开日：
20160330
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种基于高通量测序技术的动物源性成分肉类检测方法。
本发明提供的方法采样分离提取简单且快速，无须针对不同的物种线粒体DNA开发特异性的引物、不需要进行PCR扩增，能对动物源性成分肉类样品进行一次性、精确地定性分析，并可对目前绝大多数动物种属进行鉴定，同时可检测数十个样品，具有检测范围广、检测通量高等优点。
申请人：深圳华大基因科技有限公司
地址：518083 广东省深圳市盐田区北山路146号北山工业区综合楼11F-3
国籍：CN
代理机构：上海一平知识产权代理有限公司
更多信息请下载全文后查看。
利用荧光定量PCR进行饲料中牛羊源性成分检测的快速筛选姜艳彬;王海;李颖;侯东军;杨红菊;金秀娥;于雷【摘要】通过荧光定量PCR进行饲料中牛羊源性成分的快速筛选研究,其可以快速的检测饲料中是否含有牛羊源性成分,避免了常规检测中大量阴性样品造成的巨大工作量,并首次对饲料中牛羊源性成分进行定量分析,推导出定量计算公式,且灵敏度比常规的PCR检测方法高100倍以上.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】4页(P36-39)【关键词】牛羊源成分;饲料;荧光定量PCR;快速筛选【作者】姜艳彬;王海;李颖;侯东军;杨红菊;金秀娥;于雷【作者单位】中国动物疫病预防控制中心,北京,100125;中国动物疫病预防控制中心,北京,100125;中国动物疫病预防控制中心,北京,100125;中国动物疫病预防控制中心,北京,100125;中国动物疫病预防控制中心,北京,100125;湖北兽药监察所,武汉,430064;中国动物疫病预防控制中心,北京,100125【正文语种】中文【中图分类】S813.3疯牛病又称为牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy,BSE),是牛的一种神经性、渐进性、致死性疾病,最早在1985年英国的阿什福特农场发现可疑病例(张春扬等,2001)。
疯牛病的主要传播途径是饲喂被羊痒病阮病毒(p rion)污染的肉骨粉,世界上至今没有有效治疗疯牛病的方法,目前防范的唯一措施是切断传播途径。
为了防止疯牛病的蔓延,各国政府纷纷出台相关法规禁止牛羊源性饲料的使用(汤文利等,2007)。
目前,饲料中牛羊源性成分的检测方法主要有显微镜法、近红外光镜法、酶联免疫吸附反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)方法。
PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,即无细胞扩增技术,它能把微量的遗传物质迅速而简便的扩增百万倍,被广泛应用于饲料中动物源性成分的检测中。
ICS 67.050 B 45DB12鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR 法Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products天津市市场和质量监督管理委员会发布前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由天津市农村工作委员会提出。
本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。
本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。
本标准2016年9月首次发布。
鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR法1 范围本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。
本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量PCR检测。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1实时荧光PCR real time PCR实时荧光PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。
3.2Ct值cycle time每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.3内参基因reference gene能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。
3.4牛源性成分bovine-derived materials牛种属特异性DNA片段。
3.5羊源性成分ovine-derived materials羊种属特异性DNA片段。
3.6猪源性成分porcine-derived materials猪种属特异性DNA片段。
3.7鸡源性成分chicken-derived materials鸡种属特异性DNA片段。
3.8鸭源性成分duck-derived materials鸭种属特异性DNA片段。
4 原理根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的DNA特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性DNA，采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据标准参照物模板含量与Ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。
5 检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1.1DNA提取用试剂三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris饱和酚；裂解液：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH8.0），5 g/L SDS，0.1 g/L蛋白酶K；TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
5.1.2 TaqMan荧光PCR反应试剂盒5.1.3 引物和探针。
表1 动物源性成分内参基因和种属特异性基因引物和探针序列用水分别将上述引物和探针稀释到10 µmol/L，探针需避光保存。
预期扩增片段信息参见附录A，TaqMan探针引物其5′端标记荧光报告基团（如FAM、ROX等），3′端标记对应的荧光淬灭基团（如TAMRA、BHQ1等）。
5.1.4 阳性对照用已知含相应动物源性成分的样品作阳性对照。
5.1.5 双蒸水。
5.2 仪器荧光定量PCR扩增仪；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；分析天平，感量0.1 g和0.1 mg；离心机：离心力12000 g；微量移液器：0.5µL～10µL，10µL～100µL，10µL～200µL，100µL～1000µL；实时荧光PCR反应管；重蒸馏水发生器或纯水仪；恒温水浴箱。
5.3 分析步骤5.3.1 试样制备生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。
充分混匀，用四分法缩分出不少于500 g作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。
将试样于-20℃冷冻保存。
5.3.2 DNA提取取待测样本剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，液氮预冷后放入研钵中，然后缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100 mg加入2 mL灭菌离心管中；加入500 μL 10% SDS裂解液和20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，55℃水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至溶液透明；将消化后的组织裂解液加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，转移上清至一新离心管，重复1次；加入0.5倍体积的Tris饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇（24:1），缓慢颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，转移上清至一新离心管；加入0.1倍体积的乙酸钠溶液和2.5倍体积4℃预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色DNA絮状沉淀析出，-20 ℃沉淀 2 h；12000 rpm 离心5 min，加入500 μL 70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入100 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀。
5.3.3 标准曲线样品制备采用牛、羊、猪、鸡、鸭相应的标准品绘制种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。
提取动物源性成分标准物质基因组DNA，用0.1×TE或水稀释梯度稀释，标准溶液至少涵盖5个动物源性成分浓度梯度。
5.3.4PCR反应5.3.4.1 标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。
动物源性成分种属特异性基因实时荧光PCR反应按表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；16SrDNA内参基因实时荧光PCR反应按表3在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。
将PCR管放在离心机上，500 g~3 000 g离心10 s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。
运行实时荧光PCR反应。
反应程序为：95℃变性2 min；进行45次循环扩增反应（95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min）；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。
表2 动物源性成分种属特异性基因PCR反应体系表3 16SrDNA内参基因PCR反应体系5.3.4.2设置对照应设置阴性对照和空白对照。
以鲑鱼精子DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板用纯水作为空白对照PCR反应体系的模板。
各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与5.3.4.1相同。
5.3.5数据分析5.3.5.1设定阈值实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。
设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。
5.3.5.2记录Ct值设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。
5.3.5.3 绘制标准曲线根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。
标准曲线公式：式中：y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；x—模板靶标浓度以10为底数的对数；b—标准曲线的截距。
5.3.5.4数据可接受的标准动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的Ct值≥38；16SrDNA阴性对照和空白对照的16SrDNA内标基因Ct值≥38；标准曲线的R2≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1，满足上述条件，可以进行结果计算。
否则重新进行实时荧光PCR扩增。
5.3.5.5含量计算5.3.5.5.1 计算试样模板靶标浓度将试样的动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的Ct值分别带入动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的靶标浓度。
计算试样模板靶标浓度公式：a by n -=10(2)式中：n—模板靶标浓度y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。
5.3.5.5.2 计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16SrDNA内参基因的靶标浓度带入公式（3），计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。
计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：(3)式中：c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(%)；n OA-PRLP（Rd1、Sus-ACTB、Chk、Duc）—动物源性成分种属特异性基因靶标浓度；n16SrDNA—内参基因16SrDNA浓度。
6 结果分析与表述6.1 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因均出现典型扩增曲线，且16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因的Ct值<36，表明样品中检出某动物源性成分。
表述为“样品中检测出某动物源性成分，某动物源性成分含量为c”。
6.2 16SrDNA内参基因出现典型扩增曲线，且Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值≥36或未出现典型扩增曲线，表明样品中未检出某动物源性成分。
表述为“样品中未检测出某动物源性成分”。
6.3 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，16SrDNA内参基因Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值在36～38之间，应进行重复实验。
如重复实验结果符合6.1-6.2的情况，依照6.1-6.2进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。
6.4 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因未出现典型扩增曲线，或Ct值≥38，表明样品中未检出动物源性成分。
表述为“样品中未检测出动物源性成分”。
6.5 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值均在36～38之间，应进行重复实验。
如重复实验结果符合6.1- 6.4的情况，依照6.1- 6.4进行判断；如重复实验16SrDNA 内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。
