婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测李莉; 陈泽辉【期刊名称】《《中国卫生标准管理》》【年(卷),期】2019(010)018【总页数】4页(P4-7)【关键词】阪崎克罗诺杆菌; Lamp; 婴儿配方奶粉; 快速检测; 特异性; 灵敏度【作者】李莉; 陈泽辉【作者单位】厦门市疾病预防控制中心业务质量管理科福建厦门361021; 厦门市疾病预防控制中心检验科福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】R155阪崎克罗诺杆菌，又称阪崎肠杆菌，多寄生于人和动物的肠道中，为食源性致病菌，多来源于婴幼儿食品。
阪崎克罗诺杆菌有鞭毛，兼性厌氧，属于革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。
婴幼儿感染后容易造成新生儿脑膜炎、坏死性结肠炎和败血症等，对尚未发育完全的神经系统造成影响，严重者可导致死亡[2]。
近年来，阪崎克罗诺杆菌感染的发生率呈上升趋势，因而快速检测阪崎肠杆菌，并制定相应的防控方案在公共卫生领域十分重要[3]。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验用菌株本研究用到的菌株见表1。
1.1.2 样品与试剂本研究检测采用的样品婴幼儿奶粉，来源于厦门市各超市。
万古霉素试剂：北京陆桥技术股份有限公司。
阪崎肠杆菌核酸快速检测试剂盒：广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 主要仪器设备BSC-1500IIA2-X型生物安全柜：济南鑫贝西生物技术有限公司；GNP-9160型、GNP-9080型隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HV-25型高压灭菌器：日本平山制作所株式会社；Pico7500 2415型台式高速离心机：厦门联仪通医疗设备有限公司；EPPENDDO-RF型恒温金属浴：厦门宝能科技有限公司；IKA MS3型漩涡混合仪：福州齐力特实验设备有限公司；BCD-218S DA型海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。
1.3 方法1.3.1 传统分离鉴定应用GB 4789.40-2010方法，取100 mg样品，加到高压灭菌过的，44℃的装有900 mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，混匀。
在（36±1）℃的环境下培养（18±2）h，移取1 mL转种于装有10 mL的mLST-Vm肉汤，于（44.0±0.5）℃培养（24±2）h。
分离鉴定时，将43.1 g DFI溶于1升蒸馏水，加热煮沸、高压灭菌、冷却，倾注形成DFI平板，取肉汤增菌液划线接种。
划线时将平板分成面积从大到小依次为D、C、B、A的四部分，接种环先涂抹A区，然后依次在B区、C区、D区划线，避免D区划线同A区相接触，最后培养。
1.3.2 Lamp实验首先将1 mL增菌液注入离心管，离心后弃上清，洗涤沉淀后再次离心以至完全去掉上清。
将裂解液加到沉淀中，再于99℃恒温加热10 min，离心得到上清，为粗提取DNA，将其转移到0.2 mL无菌离心管中，置于-20℃冰箱保存备用。
阴性、阳性对照复溶，在初次使用需将80 μL超纯水添加至两组对照的冻干粉中，溶解、混匀，-20℃保存备用。
干粉试剂复溶时，将冻干粉试剂剪成多个检测试剂管，数量为待检测样品数+2，向管中加入20 μL复溶液后保存备用。
扩增时，将恒温设置在63℃，将显色指示剂、待检测样品核酸、阴性对照和阳性对照加到反应管中，反应50 min。
1.3.3 特异性实验选取奇异变形杆菌（CMCC 49005）、阪崎克罗诺杆菌（ATCC 29544）、粪肠球菌（AS.1.2024）、肠炎沙门氏菌（CMCC 50335）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）。
ATCC 29544使用GB 4789.40-2010法增菌，其余5种直接溶于营养肉汤，过夜培养后进行Lamp实验，从而验证特异性。
1.3.4 灵敏度实验将过夜后的人工污染奶粉10倍梯度稀释。
取10只无菌试管，依次为10-1、10-2……10-10，加9 mL的BPW，先吸取1 mL增菌液加到10-1管摇匀，再从10-1管中吸取1 mL至10-2管，依此法稀释至10-10管，每管取1 mL计数，各管均行Lamp实验，从而检测灵敏度。
1.3.5 实际样品检测对购于本地超市的20种婴幼儿配方奶粉采用GB 4789.40-2010法进行阪崎克罗诺杆菌计数，以及试剂盒的快速检测，比较以得出配方奶粉的质量，同时分析Lamp法的实用性。
2 结果与分析2.1 基本情况阪崎克罗诺杆菌菌株培养、稀释后平板计数，如图1所示。
稀释至10-5时，肉眼观察到菌落遍布平板；稀释至10-6时，菌落数分别是227和257 CFU/mL；至10-7时，菌落数分别是24和30 CFU/mL；至10-8时，菌落数分别为2和2 CFU/mL，稀释至10-9后，肉眼不可见菌落。
因此，原菌液浓度是2.0×10-8 CFU/mL。
2.2 特异性实验采用6种标准菌株进行Lamp方法特异性实验的结果，在自然光下，2号管（阪崎克罗诺杆菌）与阳性对照比较为荧光绿，1、3、4、5以及6号管与阴性对照为淡橙色，因而该试剂盒可以特异性地检出阪崎克罗诺杆菌，不可检出奇异变形杆菌（1）、粪肠球菌（3）、金黄色葡萄球菌（4）、肠炎沙门氏菌（5）和大肠埃希氏菌（6）等菌株，重复检测得到相同结果，因此，该试剂盒特异性较高。
2.3 灵敏度实验增菌液经培养，浓度为2.0×108 CFU/mL，将其梯度稀释，浓度依次为2.0×108～2.0×10-4 CFU/mL，进行Lamp实验，稀释至10-7（2.0×101CFU/mL）时结果与阳性对照比，为荧光绿；稀释至10-8及以后，与阴性对照比，为淡橙色，说明该试剂盒检测阪崎克罗诺杆菌的限值为20 CFU/mL。
用DFI计数，稀释至10-6时，尚可检测出菌落，稀释至10-7及之后不能够检出绿色阪崎克罗诺杆菌，表明DFI平板的检出限为200 CFU/mL。
因此，试剂盒灵敏度是平板计数的10倍，本结果经重复检测，得相同结果。
表1 实验用菌株图1 10 倍稀释平板计数2.4 实际样品的检测通过快速检测试剂盒对20份市售婴幼儿配方奶粉检测，样品同阴性对照相比，为淡橙色，表明未检测出阪崎克罗诺杆菌，多次检测均未检出，因此，奶粉符合率是100%。
3 讨论婴幼儿配方奶粉如发生阪崎克罗诺杆菌污染，会严重威胁婴幼儿的生命安全[4]。
目前，我国主要以分离培养检测该菌[5]，其存在检测时间长、对检测人员要求高、易受人为干扰、易交叉污染、不能大批量定量检测等不足[6-7]。
PCR技术虽可改善检测质量，但成本高、程序繁杂、实验室要求、气溶胶等也限制了其在基层的开展[8-9]。
Lamp技术具有较高的灵敏度和特异度，且快速、简单，具有较好的应用前景[10]。
本研究中试剂盒以核酸分子检测为原理，在自然光下可直接比较阴性对照管（淡橙色）及阳性对照管（荧光绿色），快速简便，减少了人为因素引起的误差。
为验证该方法特异性，本研究对6种标准菌株进行检测，结果显示较为理想，加之重复实验，进一步说明检测特异性较高。
传统分离鉴定方法与Lamp法相比，前者步骤较多，自前增菌、增菌培养，到划线接种平板培养需用时4天左右，耗时较长，如未严格无菌操作，也容易出现偏差，结果与王蕊等[11]研究结论相符。
试剂盒法检测人工污染的阪崎克罗诺杆菌，从DNA提取到LAMP扩增结束，共耗时约90分钟。
无需设计引物，缩短了时间，且操作简便，检测成本较低。
同时，结果还显示出试剂盒的灵敏度高于平板。
试剂盒对20份奶粉样品的验证实验，表明Lamp 在实际检测结果与传统方法相同，相比之下，快速检测试剂盒在耗时、操作、携带以及结果判读方面具有显著优势。
综上所述，环介导等温扩增（Lamp）技术在快速检测婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌中有高灵敏度、高特异性、快速简便、无污染等优势，在基层的快速检测具有很好的应用前景。
参考文献【相关文献】[1]冯发运，朱宏，李俊领，等．一株小飞蓬内生毒死蜱降解菌的分离鉴定及其降解特性初探[J]．农药学学报，2015，17（1）：89-96．[2]刘咪，杨保伟，夏效东，等．阪崎克罗诺肠杆菌致病性机理研究进展[J]．食品科学，2013，34（9）：329-333．[3]石超，郭都，张文婷，等．原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及机理[J]．现代食品科技，2017，33（7）：105-111．[4]石超，孙慧慧，孙正，等．百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用[J]．食品科学，2016，37（1）：58-64．[5]石超，陈怡飞，贾振宇，等． 50 种植物源化合物对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌活性评价[J]．食品科学，2017，38（13）：47-54．[6]陈万义，任婧，吴正钧，等．生鲜蔬菜中阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定[J]．食品科技，2014，40（1）：304-308．[7]周蒂，颜巧红，郝东海，等．配方奶粉加工过程阪崎克罗诺杆菌PFGE 分子分型研究[J]．中国卫生检验杂志，2014，24（22）：3232-3234．[8]张德福，赵禹宗，张明，等．添加扩增内标的PCR 方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌[J]．食品工业科技，2017，39（2）：49-50．[9]付世骞，曲艳艳，冯晓涵，等．环介导等温扩增-无电加热法检测乳中阪崎克罗诺杆菌[J]．食品与发酵工业，2017，48（3）：220-225．[10]王淞，张霞，王伟，等．乳粉中阪崎克罗诺杆菌快速检测方法应用比较[J]．食品研究与开发，2016，37（1）：157-160．[11]王蕊，杨鑫焱，陈思涵，等．一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法[J]．食品与发酵工业，2018，49（10）：212-217．。
