蓝氏贾第鞭毛虫诊断
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蓝氏贾第鞭毛虫病(外科)【概述】人体感染贾第虫后,无临床症状者称带虫者。
本病主要症状是腹痛、腹泻、腹胀、呕吐、发热和厌食等,典型病人表现为以腹泻为主的吸收不良综合征,腹泻呈水样粪便,量大、恶息、无脓血。
儿童患者可由于腹泻,引起贫血等营养不良,导致生长滞缓。
若不及时治疗,多发展为慢性,表现为周期性稀便,反复发作,大便甚臭,病程可长达数年。
【诊断】㈠临床诊断:由于没有特殊的临床症状,因此没有确切的诊断方法。
可询问有无旅游腹泻症状,并观察粪便特征,有无脓血、粘液,再作进一步检查。
㈡病原学检查:病原学检查本虫滋养体和包囊是最可靠的诊断方法。
1.粪便检查:⑴生理盐水直接涂片法:在粥样或水样粪便里可查到左右翻滚、瓢形的滋养体,运动活泼。
注意粪样必须新鲜。
⑵碘液直接涂片法:取半成形或成形粪便少许与少量卢戈氏碘液混匀,作成涂片,好可镜检包囊。
⑶硫酸锌(33%)漂浮法浓集包囊:常用接种环取上浮物于载玻片上镜检,此法检出率高。
⑷汞磺醛(MIF)沉淀法浓集包囊:离心取沉淀作涂片镜检。
由于粪便中包囊时有无,故应隔日检查,连续3次以上。
2.十二批肠引流法:取十二指肠内容物,涂片镜检滋养体及包囊。
㈢免疫诊断:1.酶联免疫吸附试验(ELISA):是诊断蓝氏贾鞭毛虫病灵敏度高、特异性强的方法。
有症状者诊断阳性率为73.5%,具有快速、操作简便等优点,仅有少数交叉反应。
不仅可以检查现症患者的抗体,对已往有过感染现已不排虫者,因其血内抗体可持续存在一段时间,因此也可检查。
2.间接血凝(IHA):由于IHA操作简单,无须昂贵设备,是诊断蓝氏贾鞭毛虫病比较好的方法,阳性率73.4%。
3.间接荧光抗体(IFA):优于IHA,血清阳性率为83.3%。
4.对流免疫电泳(CIF)试验:简便有效,适应于现场大规模流行病学调查。
采用患者的新鲜粪便(其中有该虫抗原)或低温保存时间较短者,检出率较高。
【治疗措施】此病较顽固,用抗生素治疗无效。
㈠灭滴灵(metronidazole):Green(1974)报道大剂量应用,每日2g,疗程3天,疗效100%,一般可达90%以上。
蓝氏贾第鞭毛虫病的临床表现介绍人体感染贾第虫后,潜伏期平均为1~2周,最长者45天。
相当一部分不出现任何临床症状,成为带虫者,有出现轻微症状者,也有出现严重症状者,其临床表现以腹痛、腹泻、厌食多见,典型患者表现为以腹泻为主的吸收不良综合征,可有爆发性水泻,恶臭、无脓血,含大量脂肪颗粒。
儿童久病不愈可致营养不良、贫血、发育障碍等。
如寄生在胆道系统,可出现胆囊炎或胆管炎。
若不及时治疗,多发展为慢性,表现为周期性稀便,反复发作,大便甚臭,病程可长达数年。
可分为全身性症状、胆道系统症状和肠胃道症状3类。
1.全身性症状(1)神经症状如失眠、头痛、乏力、眩晕、眼发黑、出汗、神经兴奋性增强、肌腱反射亢进等较为常见。
(2)甲状腺机能失调曾有人发现部分(15.5%)蓝氏贾第鞭毛虫病患者的甲状腺机能有改变,其中以甲状腺机能亢进占大多数,基础代谢增高16%~20%,部分患者可增高30%,因而也会产生甲状腺机能亢进的症状。
2.胆道系统症状蓝氏贾第鞭毛虫在胆道系统寄生,可以引起胆囊炎及胆管炎。
主要症状为上腹部疼痛、食欲不振、消化不良、恶心、嗳气、胃部烧灼感、肝脾肿大、有压痛,进食油腻时加重,有时可出现黄疸。
3.胃肠道症状(1)十二指肠炎型有似十二指肠溃疡样疼痛,伴有纳差、低血压等。
X线检查多显示球部变形,甚至有溃疡征。
抗虫治疗后可以消除上述症状。
(2)急性或慢性阑尾炎型症状与一般阑尾炎相似。
切除的阑尾,呈炎性病变,黏膜有时可见溃疡,绒毛间可发现大量滋养体。
(3)结肠炎型主要症状有腹部钝痛,阵阵加剧,伴恶心、呕吐、腹泻,常被误诊为痢疾。
(4)直肠乙状结肠炎型与一般直肠乙状结肠炎相同。
用乙状结肠镜检查,可见弥漫性充血、水肿、严重者有圆形溃疡,溃疡表面覆有渗出性假膜。
拭子检查可见大量滋养体。
无特殊病理改变。
急性感染的症状为突然发作,有暴发性腹泻,水样大便,很臭,伴腹痛等。
所以急性期症状很像急性阿米巴痢疾或细菌性痢疾及沙门氏菌属感染,应注意鉴别。
贾第虫病的诊断提示及治疗措施
贾第虫病(giardiasis)是由蓝氏贾第鞭毛虫引起的肠道寄生虫病。
临床上以无症状排包囊者为多,部分可有肠道症状。
【诊断提示】
1流行病学有不洁饮食史,或与患者和原虫包囊携带者有密切接触史。
2.临床表现潜伏期7~14d o根据病情可分急性、亚急性和慢性。
急性起病者,主要表现为暴发性腹泻、水样或糊状脂肪便、有恶臭、上腹饱胀、纳差、腹痛。
鞭毛虫大量寄生在阑尾,可有急性阑尾炎表现,侵及胆管,可有胆囊炎、黄疸及肝大表现。
儿童患者生长滞缓、营养不良、贫血。
3.实验室检查粪便及十二指肠引流液中可查到鞭毛虫滋养体和包囊,血清鞭毛虫抗体阳性。
【治疗措施】
(1)甲硝嗖0.2〜0.4g,儿童酌减,3次/d服,连用5〜7d0吠喃嗖酮(痢特灵)0.1g,儿童5mg∕(kg∙d),3次/d,连服IOdo 氯喳0.25g,3次/d,儿童7〜IO1ng/(kg∙d),分3次服,连用5〜7d。
替硝嘎:成人2g,儿童50〜60mg∕(kg∙d),1次/d。
(2)对症治疗。
蓝氏贾第鞭毛虫病应该做哪些检查?
*导读:本文向您详细介蓝氏贾第鞭毛虫病应该做哪些检查,常用的蓝氏贾第鞭毛虫病检查项目有哪些。
以及蓝氏贾第鞭毛虫病如何诊断鉴别,蓝氏贾第鞭毛虫病易混淆疾病等方面内容。
*蓝氏贾第鞭毛虫病常见检查:
常见检查:粪便白细胞、粪便寄生虫
*一、病原诊断
⑴粪便检查用生理盐水涂片法检查滋养体,经碘液染色涂片检查包囊,也可用甲醛乙醚沉淀或硫酸锌浓集法检查包囊。
通常在成形粪便中检查包囊,而在水样稀薄的粪便中查找滋养体。
由于包囊形成有间歇的特点,故检查时以隔天粪检并连续3次以上为为宜。
⑵十二指肠液或胆汁检查粪便多次阴性者可用此法,以提高阳性检出率。
⑶肠检胶囊法让受检者吞下装有尼龙线的胶囊,线的游离端留于口外,胶囊溶解后,尼龙线松开伸展,3~4小时后到达十二指肠和空肠,滋养体粘附于尼龙线上,然后慢慢地拉出尼龙线,刮取附着物镜检。
*二、免疫诊断
为辅助诊断,主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光
抗体试验(IFA)和对流免疫电泳(CIE)等方法,其中ELISA简单易行,检出率高(92%~98.7%)等特点,适用于流行病学的调查。
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*蓝氏贾第鞭毛虫病如何鉴别?:
*一、鉴别
应与慢性肠胃炎,痢疾,霍乱,细菌性食物中毒等疾病相鉴别。
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蓝氏贾第鞭毛虫病,蓝氏贾第鞭毛虫病的症状,蓝氏贾第鞭毛虫病治疗【专业知识】疾病简介人体感染贾第虫后出现以腹泻为主的吸收不良综合征,腹泻呈水样粪便,量大、恶息、无脓血。
儿童患者可由于腹泻,引起贫血等营养不良,导致生长滞缓的疾病。
若不及时治疗,多发展为慢性,表现为周期性稀便,反复发作,大便甚臭,病程可长达数年。
疾病病因一、病因蓝氏贾第鞭毛虫感染,虫体对机体产生的机械和化学作用,导致机体产生非特异性和特异性宿主反应。
症状体征一、症状本病主要症状是腹痛、腹泻、腹胀、呕吐、发热和厌食等,典型病人表现为以腹泻为主的吸收不良综合征,腹泻呈水样粪便,量大、恶息、无脓血。
儿童患者可由于腹泻,引起贫血等营养不良,导致生长滞缓。
取十二指肠引流液检查滋养体,对该病的诊断有重要意义。
用药治疗一、西医1、治疗常用药物有灭滴灵、丙硫咪唑、氯硝唑等。
近年来报告吡喹酮60mg/kg连服2天也有效。
2、经彻底治疗后,不发生临床症状或体征,以及粪便检查无包囊即为治愈。
3、该病预后较好,无后遗症。
二、中医1、中医偏方:为双子叶植物药茜草科植物玉叶金花或展枝玉叶金花的根。
玉叶金花...②治疗蓝氏贾第鞭毛虫病用常山2钱煎服,每日1次,连服7天预防和护理一、预防1、预防:1)检查和治疗宠物,控制动物传染源。
2)检查饮食服务业和托儿所机构人员,发现感染者及时治疗。
3)注意环境卫生、个人卫生、饮食和饮水卫生。
4)管理粪便,及时处理感染者和宠物的粪便,保护水源不受污染。
5)消灭苍蝇和蟑螂。
二、护理并发病症一、并发病症1、贫血。
二、生长迟缓。
3、水、电解质代谢紊乱。
饮食保健一、饮食蓝氏贾第鞭毛虫病吃哪些食物对身体好?主要以清淡为主,饮食均和营养丰富,注意饮食卫生,饮用煮沸水。
(以上资料仅供参考,详细请咨询医生)相关药品奥硝唑片0.25gx12片/盒国药准字H20133070¥9.00奥硝唑片0.25gx10片/盒国药准字H20133070¥4.00奥硝唑片0.25gx18片/盒国药准字H20010514¥6.04奥硝唑片0.25gx12片x2板/盒国药准字H20113125¥20.00“身体是革命的本钱”。
蓝氏贾第鞭毛虫(贾第虫)一、形态1、滋养体2、包囊二、生活史包囊(食入,小肠内脱囊)——滋养体(寄生于十二指肠小肠上段)——滋养体(二分裂繁殖,回肠后段、结肠)——包囊(成形粪便排出)三、致病1.机理(1)虫体因素:a大量虫体寄生吸盘吸附屏障作用虫群的机械阻隔。
b不同虫株(GS株、ISR 株),其致病力也不同。
c虫体吸盘及分泌物、代谢物对肠粘膜损伤。
(2)宿主因素:a免疫球蛋白水平下降:丙种球蛋白和IgA缺乏,影响抗体依赖的细胞毒性的作用,感染不能控制。
b二糖酶缺乏:加重滋养体损伤肠粘膜,是导致宿主腹泻的原因。
2.病理学改变:卡他性炎症3.临床表现:a吸收不良综合症:要症状是腹痛、腹泻,腹胀、呕吐、发热和厌食。
腹泻呈水样便、脂肪泻,恶臭、无脓血。
b胆囊炎或胆管炎四、诊断病原学检查1、粪便检查:1)腹泻粪便---生理盐水涂片法----查滋养体2)成形粪便---碘染色法/铁苏木素染色法--查包囊2、小肠液检查----查滋养体3、小肠活体组织检查----查滋养体五、流行1、分布:贾第虫病分布全球,感染率约1--20%,儿童感染率高于成人。
我国分布也很广泛,各地的感染率在2--10%之间。
2、流行因素:(1)传染源存在:排包囊的人和动物(2)包囊对外环境抵抗力强(3)粪便污染水源和食物(4)人的不卫生饮食(5)蝇、蟑螂等参与传播六、防治原则1、治疗病人和带虫者:药物:灭滴灵、呋喃唑酮、替硝唑、巴龙霉素2、加强粪便管理,保护水源3、注意个人饮食卫生4、消灭蝇、蟑螂阴道毛滴虫阴道毛滴虫是寄生于人体阴道及泌尿道的鞭毛虫,可引起阴道炎、尿道炎、前列腺炎。
是以性传播为主的一种传染病。
滴虫病分布全球,人群的感染较普遍。
一、形态前鞭毛,毛基体,核,轴柱,副基,纤维二、生活史滋养体(二分裂)——滋养体三、致病(一)致病机制1、虫株的不同:致病程度随虫株毒力强弱而异取急性患者的虫株(皮下接种)→豚鼠→皮下组织产生糜烂、脓肿取慢性患者的虫株(皮下接种)→豚鼠→不产生明显的病变虫株毒力与虫体鞭毛分泌细胞离散因子(cell-detaching factor)有关,引起阴道粘膜上皮C脱落,其生成量与临床感染的严重程度相一致。
贾第虫病诊断标准贾第虫病是一种寄生虫病,寄生在人体的小肠,胆囊主要在十二指肠,可引起腹痛,腹泻和吸收不良等症状,可导致贾第虫病的主要寄生虫是蓝氏贾第虫,以无症状带菌者存在,潜伏期多在两周左右,甚至可以达到数月不等临床症状,是病变部位而已,其表现是多种多样的,症状轻重不同。
诊断这种疾病的标准包括以下几个方面:贾第虫病患者就医后,需要完善粪便检查、十二指肠引流液或胆汁检查、肠检胶囊法、血常规检查、肝功能检查、腹部超声等,以明确诊断。
1、粪便检查:贾第虫病确诊方法,通过检查新鲜腹泻便可发现贾第虫滋养体,糊状便和成形便中多为贾第虫包囊。
2、十二指肠引流液或胆汁检查:粪便多次阴性者可用此法进行检查,检出阳性率更高,避免出现误诊、漏诊。
3、肠检胶囊法:用于粪便检查十二指肠引流液或胆汁检查均阴性的典型患者,比上述方法检出阳性率更高,避免出现误诊、漏诊。
4、血常规检查:长期感染和儿童患者均可能出现营养不良导致的贫血,若患者血细胞和血红蛋白下降,则需要考虑存在营养不良的可能。
5、肝功能检查:贾第虫可以寄生于患者胆道,损伤肝脏。
检查患者的转氨酶,可以提示患者有无肝脏的损伤。
6、腹部超声:主要用于腹部器官的检查,可以发现患者肝、胆有无病变及严重程度。
贾第虫病是可以治愈的,但是必须要选择正确的治疗方法。
首先可以选择一般治疗,病人需要直接按照肠道传染病来进行隔离,也应该给予高热量的饮食、高蛋白质的饮食。
如果症状比较严重,首先也应该纠正水电解质紊乱。
如果有胆道感染现象,就应该选择抗生素治疗。
除此之外,也可以选择服用药物的方式,譬如可以在医生的指导下,选择可是这类药物也有禁忌事项,哺乳期的妇女、孕妇不可以使用,可能会出现一系列的副作用,但是对于其余病人,疗效在90%以上。
蓝氏贾第鞭毛虫概述简称贾第虫主要寄生在人体小肠引起贾第虫病以腹泻和消化不良为主要特征在旅游者中发病率较高→又称“旅游者腹泻”1681年由荷兰Leeuwenhoek 首先在自己粪便内发现形态滋养体包囊半个倒置梨形长约9-21μm 宽约5-15μm厚约2-4μm两侧对称,前端钝圆,后端尖细,背凸腹平1对细胞核结构4对鞭毛前鞭毛后鞭毛腹鞭毛尾鞭毛1对轴柱/丝并列位于吸盘底部纵贯虫体中部不伸出体外1对中体半月形与轴柱1/2处相交依靠鞭毛作活泼的翻滚运动染色后可见细胞核、鞭毛等椭圆形长约8-14μm 宽约7-10μm 囊壁较厚与虫体间有明显空隙细胞核未成熟包囊内含2个成熟包囊内含4个细胞质可见中体和鞭毛的早期结构结构铁苏木素染色后可见2细胞核、中体、鞭毛等结构生活史简单人摄入被包囊污染的水或事物→包囊在十二指肠脱囊,形成2滋养体→借助吸盘吸附肠壁,二分裂繁殖→外界环境不利时,滋养体分泌囊壁形成包囊,并随粪便排出体外要点寄生部位主要在十二指肠内感染阶段成熟的四核包囊感染途径经口致病阶段滋养体传播阶段包囊诊断阶段滋养体、包囊致病虫株致病力机械阻隔和营养竞争大量虫体覆盖小肠粘膜虫体与宿主竞争基础营养影响粘膜吸收功能机械刺激和化学损伤吸盘对粘膜的机械性损伤分泌物和代谢产物的毒性作用宿主免疫状态先天/后天性血内丙种球蛋白缺乏者、胃肠道分泌的IgA 缺乏者对贾第虫敏感机制临床表现带虫者感染虫囊后多无症状急性腹泻腹痛、腹泻,水样便、量大恶臭、无脓血慢性腹泻周期性稀便,反复发作,病程可长达数年胆囊炎或胆管炎贾第虫偶可侵入胆道系统诊断主要-病原学诊断粪便检查肠液检查急性期病人取水样稀便,生理盐水直接涂片查滋养体慢性期病人/带虫者取成形粪便,碘液染色涂片法查包囊包囊排出有间断性→隔日查一次,连续3次十二指肠引流或场内试验法采集标本滋养体阳性检出率高流行全球性分布我国呈全国性分布儿童>成人夏秋季节发病率较高流行因素传染源传播途径易感人群任何年龄均有易感性水源传播是重要感染途径苍蝇、蟑螂等昆虫可能为传播媒介误食被污染食物可排出包囊的人和动物带虫者排出量大9亿/d包囊抵抗力强,常用消毒剂对其无作用防治治疗首选甲硝唑(灭滴灵)预防加强粪便管理,防止水污染注意个人卫生对艾滋病等免疫功能缺陷者进行贾第虫感染的预防和治疗。
小儿贾第虫病应该做哪些检查蓝氏贾第鞭毛虫病现通称贾第虫病,是由蓝氏贾第鞭毛虫寄生在人体小肠引起的原虫性疾患。
临床上以腹泻、腹痛及腹胀等为主要表现,并可引起胆囊炎、胆管炎及肝脏损害,硫酸锌漂浮法等浓缩法可提高包囊检出率。
粪便检查应三送三检,三检阳性率可提高到97%。
十二指肠引流物、小肠黏液或活检组织均可查到虫体。
2.免疫学试验可分为检测血清内抗体和粪抗原两类。
(1)检测抗体:自从蓝氏贾第鞭毛虫纯培养成功后,由于高纯度抗原制备已成可能,故大大提高了免疫诊断的灵敏性与特异性。
我国已建立两株蓝氏贾第鞭毛虫培养,为国内开展免疫诊断提供了条件。
酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接荧光抗体试验(IFA)检查患者血清抗体,前者可达75%~81%阳性,后者可达66.6%~90%阳性。
(2)检测抗原:可用酶联免疫试验(双夹心法)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)、对流免疫电泳(CIE)等检测粪稀释液中抗原。
双夹心法ELISA阳性率高达92%,Dot-ELISA也可达91.7%,CIE则可达94%。
检测粪抗原不但可用于诊断,也可以考核疗效。
3.分子生物学诊断近年有用聚合酶链反应(PCR)检测蓝氏贾第鞭毛虫核糖体RNA(rRNA)基因产物,可检测出相当于一个滋养体基因组DNA量的扩增拷贝。
也可用放射性标记的染色体DNA探针检测滋养体和包囊。
分子生物学方法具有高特异性灵敏性,因而有广阔的应用前景。
腹部B超了解肝、胆情况。
尚应做X线胸片和心电图检查。
小儿贾第虫病应该如何护理?加强水源卫生管理,注意饮食卫生,彻底治疗患者和无症状包囊携带者,消灭蟑螂、苍蝇等传播媒介,做好粪便无害化处理,保持正常免疫功能等,都是预防本病发生或流行的重要措施。
蓝氏贾第鞭毛虫诊断高正琴;贺争鸣;岳秉飞【摘要】Objective Giardia lamblia is an important pathogen of zoonosis giardiasis , it poses a potential threat to the quality of SPF (specific pathogen-free) laboratory animals cannot be ignored.The aim of this study is to establish the method of rapid diagnosis of Giardia lamblia, and analyze the test results of 516 batches form 17 manufactures.Methods Direct microscopy, Giemsa-fast staining and multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) were applied to detect Giardia lamblia.Results Numerous of Giardia lamblia trophozoites and cysts were detected in SPF laboratory animals by using direct microscopy and Giemsa-fast staining, and multiplex PCR were performed to identify 18S rDNA,β-giardin, TPI and GDH genes of DNA extracted from these trophozoites and cysts identified Giardia lamblia.Direct microscopy, Giemsa-fast staining, and multiplex PCR methods can be used to detect Giardia lamblia.Of the 2562 SPF laboratory animals studied, 22.9%(586/2562) were positive for Giardialamblia.Conclusions Direct microscopy , Giemsa-fast staining , and multiplex PCR were effective techniques with high sensitivity and specificity for rapid diagnosis of Giardia lambliain.It is not satisfactory that the results of Giardia lamblia examination in 516 batches form 17 manufactures failed to meet the requirements 100%.%目的:蓝氏贾第鞭毛虫作为一种重要的人兽共患寄生虫病贾第虫病的病原,其对SPF实验动物质量造成的潜在威胁不容忽视。
本研究的目的是建立蓝氏贾第鞭毛虫快速诊断方法,并对17个生产厂家516批2562只SPF实验动物检查结果进行分析。
方法用直接镜检法、快速姬姆萨染色法和多重PCR方法,对蓝氏贾第鞭毛虫进行检测。
结果在SPF实验动物中检出数量众多的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和包囊,鉴定出蓝氏贾第鞭毛虫18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因。
直接镜检法、快速姬姆萨染色法和多重PCR方法均能检出蓝氏贾第鞭毛虫。
17个生产厂家516批2562只SPF 实验动物蓝氏贾第鞭毛虫阳性检出率22.9%(586/2562)。
结论直接镜检法、快速姬姆萨染色法和多重PCR方法具有高度的敏感性和特异性,可用于蓝氏贾第鞭毛虫的快速诊断。
17个生产厂家516批SPF实验动物蓝氏贾第鞭毛虫检查结果未能全部符合规定。
【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P76-79)【关键词】蓝氏贾第鞭毛虫;直接镜检;快速姬姆萨染色;多重PCR;SPF实验动物;质量分析【作者】高正琴;贺争鸣;岳秉飞【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京 100050;中国食品药品检定研究院,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R332【Key words】Giardialamblia;Direct microscopy;Giemsa-fast staining;Multiplex polymerase chain reaction;Specific pathogen-free laboratory animal;Quality analysis蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)是一种呈全球性分布的寄生性肠道原虫,引起以腹泻、吸收障碍和消化不良为主的蓝氏贾第鞭毛虫病(giardiasis,简称贾第虫病),也是HIV/AIDS合并感染机会原虫。
蓝氏贾第鞭毛虫感染在旅游者中流行引起的腹泻,也称“旅游者腹泻”。
目前,贾第虫病已被列为全世界危害人类健康的十种主要寄生虫病之一[1-5]。
近年来,无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)实验动物已广泛应用于食品药品生物制品医疗器械的检定和研究。
中华人民共和国国家标准(GB/T 14922.1—2001)规定:鞭毛虫(flagellates)是SPF实验小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猴均应排除的寄生虫项目之一,但国家标准中未列出蓝氏贾第鞭毛虫的检测方法[6-7]。
因此,快速准确检测蓝氏贾第鞭毛虫是一个重要问题。
目前,尚未见不同方法检测SPF实验动物蓝氏贾第鞭毛虫的报道和有效数据。
本研究建立了蓝氏贾第鞭毛虫直接镜检法、快速姬姆萨染色法和多重PCR检测方法,对17个生产厂家516批2562只SPF实验动物蓝氏贾第鞭毛虫进行检测,对检测的准确性进行评估,并对检验结果进行分析讨论,希望对SPF实验动物生产厂家及检验单位有参考作用,从而共同提高SPF实验动物的质量,防止蓝氏贾第鞭毛虫污染。
1.1 仪器设备生物安全柜(Thermo Fisher Scientific,美国);LEICA DM2500生物显微镜(Leica Microsystems,德国);倒置显微镜及成像系统(Nikon,日本);二氧化碳培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司);基因扩增仪(Applied Biosystyem,美国);凝胶成像分析系统(东乐自然基因生命科学公司)。
1.2 样品来源本试验所用样品来自17个生产厂家516个批次2562只SPF实验动物。
对于猴、犬活体采集新鲜粪便,对于兔、豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠则安乐死后采集肠样本。
1.3 直接镜检取待测样本,放入洁净离心管中,加入生理盐水,轻轻吹打混匀,室温静置5 min,吸取中上层液体滴片,直接镜检,采用实时动态显微视频摄录结果。
1.4 快速姬姆萨染色取待测样本,放入洁净离心管中,加入磷酸盐缓冲液稀释,轻轻吹打混匀,室温静置5 min,吸取中上层液体滴片,用新鲜配制的姬姆萨快速染色,采用实时动态显微视频摄录结果。
1.5 虫体离体生存能力试验取待测样本,放入洁净离心管中,加入磷酸盐缓冲液,轻轻吹打混匀,室温静置5 min,1000 × g离心5 min,弃上清,沉淀重新以磷酸盐缓冲液吹打悬浮,小心收集数条鲜活虫体,放置于新鲜配制的含10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM 培养液中,37℃ 5% CO2实验条件下放置,倒置显微镜下观察虫体存活状态,实时拍摄记录结果。
1.6 多重PCR针对蓝氏贾第鞭毛虫18S r DNA、β-giardin(β-贾第虫素)、磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TPI)和谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase,GDH)基因设计四对引物。
多重PCR引物名称、序列和产物大小见表1。
同上收集SPF实验动物样本中的数条鲜活虫体,放置于洁净离心管中,用德国Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒,按说明书操作快速提取样品基因组DNA。
以抽提的DNA为模板,同时用刚地弓形虫、结肠小袋纤毛虫、四翼无翅线虫DNA作为蓝氏贾第鞭毛虫多重PCR扩增时的阴性对照。
PCR总反应体系为50 μ L,包括10 × Buffer (Mg2+ Plus) 5.0 μ L、dNTP Mixture 4.0 μ L、正反向引物(1.0 μmol/μL)各0.5 μ L、EX Taq(5 U/μ L)0. 25 μ L、模板DNA 2.0 μL、nuclease-free water 37.75 μL。
循环参数:94℃ 5 min 1 循环;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,35 循环;72℃ 10 min 1 循环。
琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR扩增产物。
2.1 直接镜检结果吸取SPF实验动物肠样本中鲜活虫体,快速滴片,实时动态显微视频摄录记载虫体形态特征及运动方式:高倍镜下观察,可见数量众多的鞭毛虫滋养体(trophozoite)和包囊(cyst)。
外观略显无色透明的鲜活的鞭毛虫滋养体借助鞭毛摆动快速翻滚运动,鞭毛虫包囊移行速度较慢。
鞭毛虫滋养体呈纵切为半的倒置梨形,大小为(8~16)μm ×(5~12)μm,前端宽钝,后端尖细,腹面扁平,背部隆起,两侧对称,有前、后侧、腹侧和尾鞭毛共四对。
鞭毛虫包囊为椭圆形,大小为(8~12)μm ×(7~10)μm(彩插8图1)。
依据鞭毛虫滋养体和包囊大小形态特征及运动方式,鉴定为蓝氏贾第鞭毛虫[8]。
2.2 快速姬姆萨染色结果用新鲜配制的姬姆萨液,对SPF实验动物肠样本中鲜活虫体进行快速染色,实时动态显微视频摄录记载虫体形态特征及运动方式:高倍镜下观察,可见大量蓝色半透明鞭毛虫滋养体和包囊。
滋养体呈典型的“笑脸样”特征,一对细胞核位于虫体前端1/2的吸盘部位。
一对前鞭毛由此向前伸出体外,其余三对发出后在两核间沿轴柱分别向体两侧、腹侧和尾部伸出体外。
未成熟包囊内含2个细胞核,成熟包囊内含4个细胞核(彩插8图2)。
依据鞭毛虫滋养体和包囊大小形态特征及运动方式,鉴定为蓝氏贾第鞭毛虫。
2.3 虫体离体生存能力试验结果将从SPF实验动物肠样本中收集到的蓝氏贾第鞭毛虫鲜活虫体,37℃ 5% CO2实验条件下放置,结果发现:在37℃蓝氏贾第鞭毛虫滋养体能够存活一周。