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生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。
本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。
第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。
一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。
常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。
本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。
其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。
破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。
2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。
常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。
本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。
其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。
凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。
3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。
本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。
反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。
二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。
常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。
本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。
其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。
2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。
生物化学与分子生物学实验指导实验一维生素C的含量测定一、实验目的1.掌握碘量法测定维生素C的原理和方法；2.了解维生素C常用的含量测定方法。
二、实验原理维生素C又称抗坏血酸、系人体一种重要营养素。
为水溶性，主要存在于新鲜蔬菜、水果中(其中西红柿、鲜枣、山楂、辣椒、桔子中含量最多)。
其主要生理功能是：促进体内胶元蛋白及粘多糖合成;增加毛细血管壁致密性，减低其脆性与通透性;参加体内氧化还原反应;有解毒作用。
如缺乏维生素C可发生坏血病。
临床用于各种维生素C缺乏症、肝脏疾病、中毒等。
本试验是利用碘酸钾做氧化剂。
即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾—淀粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。
当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘被维生素C还原，直至维生素C完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘因无维生素C的作用，可使淀粉指示剂呈蓝色，即为中点，其反应如下：KIO3 + 5KI + 6HCl→6KCl + 3H2O + 3 I2三、实验材料柑橘或辣椒、研钵、天平、2%盐酸、0.5%KI、0.001N KIO3、1%淀粉溶液、蒸馏水、100mL容量瓶、纱布、50mL烧杯、移液管、滴定管四、实验方法（一）样品液的制备将柑橘或辣椒样品先纵切为4-8等分，除去不能食用部分，切碎，取20g作分析用。
将称取的样品放入研钵中，加2%的盐酸5-10mL，研磨至呈浆状，小心无损地移研钵中样品于100mL容量瓶中，研钵用2%盐酸液冲洗后，亦倒入量瓶中，并加2%盐酸至100mL，充分混合，用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。
（二）样品液的分析在50mL的烧杯中，用移液管注入0.5%的KI溶液1mL，1%淀粉液1mL，以及上述制得的试液5mL；再加蒸馏水至总体积10mL。
用0.001N KIO3溶液滴定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点（一分钟不褪为止）。
记录所用KIO3溶液毫升数。
同上法再测定3次，取各次测定的平均值，按下式计算维生素C含量。
生物化学与分子生物学实验1.分光光度计（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度。
（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。
其数学表达式为：A＝-lgT＝εbcA：吸光度，又称光密度“”；ε：吸光系数〔L·mol－1·cm－1〕；比例常数，称吸光系数b：样品光程〔cm〕，通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm；c：样品浓度〔mol/L〕。
吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。
这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。
假设溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。
例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm的吸光度为，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为，已知其摩尔吸光系数×103 M-1cm，计算其摩尔浓度.∵A＝εbC∵A＝〔溶剂加样品的吸光度〕－〔溶剂的吸光度〕∴A＝－＝∵b＝1cm∴×10-5 mol / L〔2〕等电点的计算方法；标准曲线的制作〔1〕配置一系列浓度不同的标准溶液。
〔2〕在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。
〔3〕以标准溶液浓度为横坐标〔不必考虑显色剂等引起的浓度变化〕，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。
〔4〕在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。
2、酪蛋白的提取过程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为。
利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白。
(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH４.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠PPT后面问题：〔1〕醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？醋酸缓冲液：调节PH到等电点。
《生物化学》和《分子生物学》课程实验教学大纲
课程名称：生物化学与分子生物学实验技术
英文名称：Experiment Technology of Biochemistry and Molecular Biology
课程编号：实验课性质：必修
课程负责人：崔行开放实验项目数：3
一、学时、学分
课程总学时：70
课程总学分：2.0
二、适用专业及年级
本大纲适用于医疗、公共卫生、口腔、护理、预防医学七年制学生。
三、实验教学目的与基本要求
掌握人体生命的物质基础，生物大分子的结构和功能。
掌握各种生物物质能量的正常代谢过程，代谢调节，代谢障碍和临床疾病的关系。
通过实验掌握基本的生物化学实验技术及验证部分课堂理论知识。
在实验教学中，要求学生掌握电泳技术、层析技术、分光光度法、离心技术、蛋白质及分子生物学等技术。
掌握蛋白质、核酸、酶类的提取、测定，学习血液成分生化测定，以及部分生物化学理论知识的验证。
掌握紫外—可见分光光度计、高速离心机、PCR仪、层析系统、电泳仪系统、电热恒温水浴箱、凝胶扫描仪、电动匀浆器等仪器的使用，了解其性能、适用范围及注意事项。
四、主要仪器设备
紫外—可见分光光度计、高速离心机、PCR仪、层析系统、电热恒温水浴箱、凝胶扫描仪、电泳仪、电动匀浆器等。
生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术是现代生物科学研究中不可或缺的重要工具。
它们通过一系列的实验技术和方法，帮助研究者深入了解生物大分子的结构、功能以及生物分子之间的相互作用。
本文将重点介绍生物化学与分子生物学实验技术的一些常用方法和应用。
一、蛋白质纯化技术蛋白质是生物体内最重要的大分子之一，其功能多种多样，参与了生物体内的各种生命活动。
而蛋白质的研究离不开纯化技术。
目前常用的蛋白质纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析和透析等。
这些方法可以根据蛋白质的特性和目的进行选择，从而获得高纯度的蛋白质样品，为后续的分析和研究提供了可靠的基础。
二、核酸提取与分离技术核酸是生物体内信息传递和遗传的基础分子，对于研究生物体的基因组结构和功能起着重要作用。
核酸提取与分离技术是研究核酸的关键步骤。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
通过这些方法，可以从不同来源的生物样品中提取出高纯度的DNA或RNA，为进一步的PCR扩增、酶切、测序等实验提供可靠的样本。
三、蛋白质电泳技术蛋白质电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可以根据蛋白质的分子量和电荷进行分离和鉴定。
常见的蛋白质电泳方法包括SDS-PAGE和二维电泳。
其中，SDS-PAGE通过蛋白质与SDS（十二烷基硫酸钠）的结合，使蛋白质带负电荷，从而根据蛋白质的分子量进行分离；而二维电泳则结合了蛋白质的分子量和等电点，可以更精确地分离复杂的蛋白质混合物。
四、PCR技术PCR技术（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术，其原理基于DNA的双链结构和DNA聚合酶的酶活性。
通过PCR技术，可以迅速扩增出目标DNA片段，并进行后续的测序、克隆、基因组分析等实验。
PCR技术具有高度灵敏性和特异性，已成为现代分子生物学研究中的重要手段。
五、基因测序技术基因测序是研究基因组结构和功能的重要方法。
随着测序技术的不断发展，高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）已成为目前最常用的基因测序方法之一。
实验步骤：一：RT-PCR检测1、用冷的PBS冲细胞2次，加入1mL Trizol(12孔板每孔加入0.5ml)，静置3-4min。
将裂解液转入已标记好相应批次的灭酶EP管中，加入氯仿0.2ml（1/5Trizol体积），用手剧烈震摇15s，置室温5min可见分层。
将离心机预冷至4°C，12000rpm，30min，可见分层。
2、小心吸上层水相约0.5ml，置于另一1.5ml灭酶EP管，此操作确保不要吸入中间层和有机相，降低蛋白质等污染。
各管分别加入0.5ml（等体积）异丙醇，摇匀，置于-80°C，过夜放置。
4°C，12000rpm，30min，可见白色片状RNA沉淀。
3、倒弃上清液，加入1ml预冷的75%DEPC乙醇，用手指轻弹管壁使RNA飘起，充分清洗RNA沉淀，4°C 12000rpm，15min。
洗涤2遍。
4、弃上清后，将管底余液尽量吸净。
室温干燥沉淀约20min，加入20μl DEPC水，充分溶解离心。
取1μl测OD值确定RNA浓度ng/μl，其余-80°C保存备用。
5、按照罗氏逆转录试剂盒进行逆转录，体系为20μl。
反应体系6、用7900仪器进行RT-PCR，采用SYBR Green法。
Note:逆转录过程中，需建立无RNAse环境，避免RNA的降解。
在冰排上进行相关操作。
二：HUVEC细胞培养（一）人脐静脉内皮细胞的分离提前准备好溶于PBS溶液的I 型胶原酶液并过滤除菌。
1、选取健康孕妇无病毒感染、无扭曲、打折的新生儿新鲜脐带（15-20cm），用0.9%的生理盐水检查脐带的完整、并冲洗内壁血细胞等；2、双向确认脐带无破损后，将脐带两头都用止血钳和注射器针头插入静脉夹紧，将I型胶原酶液注入脐带内，把脐带静置于存有生理盐水的培养皿内15min，可轻柔按摩血管以增加细胞脱落，同时控制消化时间在20min以内。
3、消化完成后，将脐带内的消化液打出到一个干净的50ml离心管内，用盐水冲洗脐带内残余消化液至离心管20ml处，将离心管800g，8min，再取一根脐带进行相同步骤；4、离心后，弃上清，用5ml培养基吹吸两管沉淀混匀后，将全部液体转移至T25细胞培养皿内，标记细胞种类、日期、姓名，松口放入37°C，5%的CO2培养箱培养细胞，第二天细胞贴壁后，观察。
生物化学与分子生物学实验1.分光光度法：是指根据物质对光的吸收特性和吸收强度,对物质进行定性和定量的分析方法。
是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。
mbert-Beer定律：吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通过溶液的距离（即光程）成正比，用数学表达式为：A=KLC3.凝胶层析：是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时,混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。
分子量最大的物质最先出柱，分子量最小的物质最后出柱。
介乎中间的物质，则分子量越大洗出越快，分子量越小洗出越慢。
4.层析：指利用各组分物理性质的不同，随流动相通过固定相时分离速度不同将多组分混合物进行分离及测定的方法。
4.电泳：带点颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，称为电泳。
以聚丙乙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙乙烯酰胺凝胶电泳PAGE，PAGE机械强度好，对pH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用，可以控制孔径大小，重复性好。
5.电渗：是指在电场的作用下，带电荷的液体对携带相反电荷的固体支持物相对运动的现象。
6.聚丙烯酰胺凝胶交联度：用C％表示，即Bis占Acr和Bis总克数的百分数。
C=b/(a+b)*100% a（b）为凝胶所含Acr（Bis）克数，m为凝胶溶液的毫升数。
7.聚丙烯酰胺凝胶浓度：用T％表示，即100ml凝胶溶液中所含Acr和Bis的总克数。
T=(a+b)/m*100% 一般情况下，体内蛋白质多采用7.5%浓度凝胶，所得电泳结果是满意的，称为标准胶。
8.Km值：即米氏常数。
根据米氏方程，Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数。
9.百分吸光系数是指在一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml，光程为1cm时的吸光度，单位是ml/(g·cm)。
10.摩尔吸光系数指一定波长时，溶液的浓度为1 mol/L，光程为 1cm时的吸光度值，用ε表示，单位是L/(mol·cm)。
名词解释吸光度：是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。
盐析：一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。
转子效率因子（K值）：是用来描述在一个转子中，将粒子沉降到离心管底的效率。
保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间。
外标法：与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
泳动度：带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度（mobility）。
单克隆抗体：只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。
序列标签位点（STS）：所谓的STS是在染色体上定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列。
定向克隆：将待克隆的核酸分子按一定的方向连接入载体的分子克隆方法。
比较基因学：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。
摩尔吸光系数：是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用ε或EM表示。
相对离心力：在离心场中施加于离心物质上的作用力。
与离心速度(r/min)和离心半径(r)成正比，单位为“g”，即以离心力相当于重力加速度(g)的倍数来衡量。
分配系数：物质在两种不相混的溶剂中平衡时的浓度比。
不同的物质在同一对溶剂中的分配系数不同，可利用该原理对物质分离纯化。
反离子：粘粒吸附决定电位离子层带电后，靠静电引力吸引溶液中电性相反的离子聚其周围，这部分离子称反离子。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
一动物组织蛋白质得提取【目得要求】1掌握动物组织蛋白质得提取方法。
2了解动物组织蛋白质提取得原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上得差异很大,即或就是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同得体系中,因此不可能有一个固定得程序适用各类蛋白质得分离。
但多数分离工作中得关键部分基本手段还就是共同得,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合得蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质.蛋白质在不同溶剂中溶解度得差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团得比例,其次取决于这些基团得排列与偶极矩。
故分子结构性质就是不同蛋白质溶解差异得内因.温度、ｐH、离子强度等就是影响蛋白质溶解度得外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要得物质分开。
但动物材料中得蛋白质有些以可溶性得形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离.蛋白质中得角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当得溶剂洗去可溶性得伴随物，如脂类、糖类以及其她可溶性蛋白质,最后剩下得就就是不溶性蛋白质.蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物即得粗提取液。
【试剂器材】1实验小鼠20、9ＮaCｌ3动物组织蛋白裂解缓冲液Ｔris 50ｍＭ，ＮａC1150mM ，ＥＤTA ０、5mM ，DTT 1mM ,TriｔoｎＸ—1001,去氧胆酸钠０、5,SDＳ0、14，PＭSF/异丙醇储备液100mM，174mg／1０mｌ于—20℃储存5－2０℃储存得冰块。
【操作步骤】1、颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取０、６g置于含预冷0、９NａＣ16mＬ得平皿中。
２、在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。
3、在预冷得裂解缓冲液中添加PMＳF／异丙醇储备液20?Ｌ／2mＬ。
生物化学实验指导书生命科学与工程学院目录实验一总糖的测定 (2)实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应 (5)实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应 (9)实验四氨基酸的分离鉴定―纸层析法 (13)实验五血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (15)实验六酪蛋白的制备 (18)实验七酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 (20)实验八肝细胞核中核酸（RNA和DNA）的分离与测定 (22)实验九紫外吸收法测定DNA含量 (25)实验十维生素C的定量测定 (26)实验十一酶的特性 (29)实验十三小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 (37)实验十四植物体内的转氨基作用 (40)实验十五SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 (44)实验十六葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 (50)实验十七质粒DNA的提取 (55)实验十八质粒DNA的酶切 (57)实验十九 PCR基因扩增 (59)实验二十琼脂糖凝胶电泳检测DNA (61)实验二十一真核生物基因组DNA制备 (63)附录 (65)实验一总糖的测定一、目的掌握直接测定法测定总糖的原理和方法。
二、原理样品经处理除去蛋白质等杂志后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。
三、器材1.电炉2.滴定管3.锥形瓶4.容量瓶四、试剂1.6mol/L 盐酸溶液2.%甲基红乙醇溶液：称取甲基红，用60%乙醇溶解并定容至100ml。
3.20%氢氧化钠溶液。
4.%转化糖标准溶液：称取105℃烘干至恒重的纯蔗糖，用水溶解并移入1000ml 容量瓶中，定容，混匀。
取50ml 于100ml 容量瓶中，加6mol/L盐酸5ml，在68-70℃水浴中加热15min，取出于流动水下迅速冷却，加甲基红指示剂2 滴，用20%NaOH 溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。
此溶液每毫升含转化糖1mg。
5.费林氏A液：称取15g（CuSO4·5H2O）及次甲基蓝，溶于水并稀释到1L。
生物化学与分子生物学实验教程第三版教学设计1. 实验目的本实验旨在让学生通过实践了解生物化学和分子生物学的基本原理和实验方法，培养学生观察和分析实验结果的能力，掌握实验操作和数据处理的技能。
2. 实验内容2.1. 生物化学实验实验一：蛋白质的定性分析实验目的：通过观察与检测不同蛋白质的特异性反应和化学性质，了解蛋白质的定性分析方法。
实验步骤：1.分别取鸡蛋清、牛奶、豆浆、红肉、白笋、蜜蜂花粉等不同来源的蛋白质样品，制备蛋白质溶液；2.分别进行百里酮、迈克尔试剂、伯胺酸试剂的反应，观察其颜色和沉淀等变化，以判断蛋白质的特异性反应和化学性质。
实验二：酶的活性测定实验目的：通过测定不同条件下不同酶的活性，了解酶的特性和活性测定方法。
实验步骤：1.制备适量的淀粉、蜂蜜等样品；2.分别制备酶和对照组，分别在不同条件下进行反应，如温度、pH、底物浓度等变化；3.根据反应结果测定酶的活性。
2.2. 分子生物学实验实验三：DNA的抽提实验目的：通过DNA的抽提，了解DNA的物理性质和抽提方法。
实验步骤：1.从植物、动物细胞或血液中抽取DNA；2.使用酶切、PCR等方法进行DNA检测。
实验四：蛋白质的表达与纯化实验目的：通过大肠杆菌等常见细菌表达蛋白质，了解蛋白质表达和纯化方法。
实验步骤：1.构建表达载体并转化至大肠杆菌中；2.制备蛋白质溶液并进行纯化。
3. 实验方法3.1. 实验前准备1.备齐实验仪器、材料；2.熟悉实验内容、方法和安全注意事项；3.按照实验要求进行制备试剂、培养菌种等。
3.2. 实验操作1.严格按照实验步骤和要求操作；2.实验过程中注意安全、卫生和环境保护；3.记录实验结果、数据和观察记录。
3.3. 数据处理1.对实验数据进行统计和分析；2.制作实验报告和结论；3.学生讨论和交流实验结果和体会。
4. 教学评估4.1. 实验报告1.学生需要按照要求编写实验报告；2.实验报告需要包括实验背景、目的、方法、结果、结论等内容；3.评分标准包括实验操作、数据处理、实验报告质量和论文撰写能力等方面。
生物学实验B实验一不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。
[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉（微波炉）二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
（由于所需药品为为神经毒性物质，注意不要经口鼻吸入，皮肤不要碰到药品，所以称量时，请戴上口罩，带好手套）2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。
可编辑修改精选全文完整版生物化学与分子生物学实验原理Principles of Biochemistryand Molecular Biology Techniques课程简介本课程主要是介绍常用分子生物学技术测定的原理和机制，以利于研究生了解分子生物学常用技术，并能活用这些技术。
这门课既不同于一般的分子生物学理论课，也不同于实验方法流程的介绍。
该课程分实验技术理论和实验操作两部分。
实验技术理论部分主要通过基因重组技术、目的基因的获得、分子杂交、基因多态性和基因表达调控等，介绍分子生物学实验的方法、设计思路、原理、操作技巧及应用等。
力求培养学生掌握现代分子生物学实验的基础与操作要点，同时邀请校外资深专家介绍分子生物学的新技术及新方法，为今后进一步深入研究奠定良好基础。
实验操作部分另设课程为“分子生物学实验技术”。
This course includes two sections. One section focus on the principles of the techniques used to isolate, identify, modify and analyze three key molecules: DNA, RNA and proteins. The first section includes: DNA recombination technology, molecular hybridization, gene polymorphism, and regulation of gene expression. The second section will be a separate course named the Techniques of Molecular Biology. The goal of this course is to giving students an on-bench training of basic molecular biology techniques.教学大纲一、课程名称：生物化学与分子生物学实验原理二、总学时数及学分：32学时，1.5学分理论课32学时三﹑授课对象：博士生、硕士生预修知识要求：要求有化学、生物学、遗传学、生物化学及微生物学相关知识四、教学目的及要求：目的：通过教学力求培养博士生、硕士生掌握现代生物化学与分子生物学实验的基础理论与基本操作要点，为今后的研究工作奠定良好基础。
生物化学与分子生物学实验1.分光光度计（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度。
（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。
其数学表达式为：A＝-lgT＝εbcA：吸光度，又称光密度“O.D”；ε：吸光系数（L·mol－1·cm－1）；比例常数，称吸光系数b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm；c：样品浓度（mol/L）。
吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。
这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。
若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。
例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M-1cm，计算其摩尔浓度.∵A＝εbC∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10-5 mol / L（2）等电点的计算方法；标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。
（2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。
（3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。
（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。
2、酪蛋白的提取过程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.8。
利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白。
(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH４.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠PPT后面问题：（1）醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？醋酸缓冲液：调节PH到等电点4.8。
蒸馏水：出去沉淀中的可溶物。
乙醇：除去沉淀中的脂类物质。
丙酮洗涤：脱水。
（2）最后所得的沉淀中加入0.1mol/L NaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定。
（3）制备高产率酪蛋白的关键是什么？刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到4.7,越接近越好,这是最主要的。
（4）请设计另一种提取酪蛋白的方法。
1、向酪蛋白溶液中加入高浓度(NH4)2SO4溶液2、10000转/分,5分钟，去上清液3、95%乙醇4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液4、丙酮4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液5、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、双缩脲法测蛋白质含量(1).蛋白质测定的5种方法:凯式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法双缩脲法（Biuret 法）Folin-酚试剂法（Lorry法）考马斯亮蓝法（Bradford法）TCA：三氯乙酸4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合，使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
在595nm下测定的吸光度A595，与蛋白质浓度成正比。
(1).干扰物质有哪些？TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等(2).G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基，染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
(3).PPT后的4个思考题。
说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g氮，试验中可以除去非蛋白氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。
其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是相对于标准蛋白含量而言的。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些？(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等。
(3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
在实验中，使用的水一定是蒸馏水吗？为什么？因为Bradford检测中要用的试剂配制,标准曲线的制作都要用到水.如果不是使用蒸馏水,可能水里面会有一些游离的离子或者电解质,会影响试剂配制的准确性,干扰实验结果.而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应,这样制作的标准曲线会比实际值偏高,导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低。
SDS干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么？当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。
但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。
由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。
由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。
要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。
K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。
5、醋酸纤维薄膜电泳原理：生物分子在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向不同分子以不同速度移动。
电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、自身大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度等。
(1).结合实验报告册，回忆操作过程，首先醋酸纤维薄膜先看粗糙面，在粗糙面上画点样线，画好后做标记，泡在缓冲溶液中浸泡完全（上面无白斑），然后点样，点样后放掉电泳槽中电泳，电泳后染色，然后脱色。
（熟悉整个过程，如果把过程打乱，能否正确排序？）（选择题）结果是5条带，哪条带最接近点样线，哪条线最远。
要求会画图，画图要记得画点样线。
(2).血清蛋白的临床意义。
组成：白蛋白、α1、α2、β和γ-球蛋白;功能：维持血浆胶体渗透压；调节血浆pH值，维持酸碱平衡；运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等；免疫作用。
血清蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为60～80g/L减少：长期慢性发热、大面积烧伤（白细胞增多），恶性肿瘤、肝癌（淋巴细胞和核细胞增多），肝功能严重受损、肝坏死、肝硬化（谷丙转氨酶增多），甲状腺功能亢进、浆膜渗出性损害、结核病、慢性腹泻、慢性肝炎、肾病综合征、吸收不良综合征，营养不良、贫血（红细胞，红蛋白稍偏低）等。
增加：大量出汗、多发性骨髓瘤、腹泻、巨球蛋白血症、严重呕吐、中毒等。
6、血糖测定（吴宪血糖测定法）(1).吴宪血糖测定法的优势（波长620nm）:优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多工作原理：葡萄糖＋ Cu(OH)2→ Cu2O↓Cu2O ＋磷钼酸→钼蓝钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比，所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定血糖的含量（波长620nm)。
（2）为什么选用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果（3）水浴8min后，取出为何切记摇动？氧化亚铜易已被氧化（4）空腹血糖的正常范围：一般空腹全血血糖为3.9～6.1mmol/L(70～110毫克/分升)，血浆血糖为3.9～6.9mmol/L(70～125毫克/分升)。
空腹全血血糖≥6.7mmol/L(120毫克/分升)、血浆血糖≥7.8mmol/L(140毫克/分升)，2次重复测定可诊断为糖尿当空腹全血血糖在5.6mmol/L(100毫克/分升)以上，血浆血糖在6.4mmol/L(115毫克/分升)以上，应做糖耐量试验。
当空腹全血血糖超过11.1mmol/L(200毫克/分升)时，表示胰岛素分泌极少或缺乏。
因此，空腹血糖显著增高时，不必进行其它检查，即可诊断为糖尿病。
（5）PPT后的3个思考题Folin-吴宪法为什么要用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多，缺点是费时，要精确控操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性比较差，干扰物质比较多进行比色法测定时，如果测得样品的A值超过100%，该如何处理，为什么？测得样品值超过100%是因为有其它还原物质，使其待测液中血糖的浓度过高所造成的，应该将待测液稀释后再进行比色。
7、谷丙氨酸酶的临床意义；（1）、谷丙氨酸酶的测定方法；知道什么是赖氏法，什么是改良赖氏法？（2）、改良后的方法优势在哪？1.反应温度：40℃改为37℃；2.底物浓度：高改低；3.套用卡门氏单位，与速率法一致，反映了酶的真实活性（3）、在做实验时用到α—酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他们的原理以及试剂的作用；（4）、该实验的注意事项：2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果；在测定时，如酶活力较大（大于150KarU ），应将样品稀释后再进行测定。
（5）、PPT后的6个思考题1、ALT的临床意义? AST的测定对于肝病的诊断具有十分重要的意义，特别是AST/ALT比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义，是临床诊治肝病的重要指标之一2、血清谷丙转氨酶测定的注意事项？以及为何要避免溶血？常温下标本不宜久存，（2）严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照组（3）当标本的酶活性超过150K时，应将血清中用0.145mol/L氯化钠稀释重做，其结果乘以稀释倍数（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接显色物，NAOH的浓度与显色深浅有关，因此它们的浓度必须很准确（5）丙酮酸标准浓度要求十分精确（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后应充分混匀当溶血之后，红细胞中的ALT会进入血液中，导致测得的实验数据较大，不符合实际情况3、对照管的意义是什么?减少非试验因素对实验结果的影响4、底物液为何要37℃预温5min?人体的体温为37℃，只有在此温度下酶的活性才会达到最大，因此必须先让酶的活性达到最大才与底物反应5、为什么在制作标准曲线时要加入基质液？使反应的溶液体积相同，减少因体积不同而造成的实验非决定性因素的影响6、为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同，对反应没有影响？基底液与底物和酶都不反应，它的作用只是调节溶液的体积酶活性的单位：国际单位：1961年酶学委员会建议使用统一单位，在规定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。
