实验10、 微生物的数量测定

第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法.前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。

该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。

后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。

利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？【提示】血球计数板测出的是全部菌体数,而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。

二、间接计数法的实验设计1．制备土壤稀释液取土壤表层5~10 cm处的土样.准确称取1 g土样，放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min后制成102倍的稀释液.然后进行系列稀释,得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。

2．取样及倒平板3．培养4．观察记录（1）计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30～300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落为宜。

（2）计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品菌数＝错误!×稀释倍数.预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、微生物生长量的测定1.测重量法干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤1～5次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100～105 ℃之间,再称重。

以细菌为例,一个细胞一般重约10－12～10－13g，也可在较低温度（如40 ℃)下进行真空干燥。

湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%~25％。

2．计数法(1)直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

此法的缺点是不能区分死菌与活菌。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0。

《环境微生物新技术》课程作业2.微生物数量测定方法有哪些？空气、水、土壤样品分别适用哪些方法？请举例说明。

常见微生物数量的测定方法<1>1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。

取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。

由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。

本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。

因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法 :常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。

取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。

此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。

使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。

细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。

湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

实验10 细菌计数返回目录一、显微镜直接计数法【原理】显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌板)，于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、直观的方法。

该法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，目前国内外常用的计菌板有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌板以及Hawksley计菌板等，血球计数板适用于菌体较大的酵母菌或霉菌孢子的计数，后两种计菌板适用于一般细菌的计数。

这几种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜。

这里介绍血球计数板方法计数酵母菌数量。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分为16个中方格(四角的四个大方格)，每个中方格又分25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格(中央的一个大方格)，而每个中方格又分成16个小方格，即计数区都由400个小方格组成(图1-3-12)。

图1-3-12 血细胞计数板构造计数区（一个大方格）边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。

已知：1ml体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4×106个小方格。

因此：每ml菌悬液中含有细胞数＝4×106×每个小格中细胞平均数×菌液稀释倍数。

实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。

二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。

3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。

由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。

由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。

如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。

大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。

我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。

检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。

它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。

取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。

取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。

注意手指不得触及瓶口内部。

在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。

如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。

2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。

3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。

微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。

它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，也存在于人体内外。

了解微生物的数量对于环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有重要意义。

本文将介绍几种常用的微生物数量测定方法。

1. 直接计数法直接计数法是最直接、最常用的微生物数量测定方法之一。

它通过显微镜观察和计数来确定微生物的数量。

首先，将待测样品制备成适当的悬浮液，然后在显微镜下观察，并使用计数器进行计数。

这种方法适用于细菌和酵母等较大的微生物。

但是，由于显微镜观察需要较高的技术水平和时间，所以无法快速测量大量样品。

2. 培养法培养法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过培养微生物并计数生长的菌落来确定数量。

首先，将待测样品制备成适当的培养基，然后在恰当的温度和湿度条件下培养一段时间。

培养基中的微生物会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。

这种方法适用于大部分微生物，但是它需要一定的培养时间，并且某些微生物可能无法在常规培养基上生长。

3. 膜过滤法膜过滤法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过将待测样品过滤到膜上，并将膜培养在适当的培养基上来确定数量。

首先，将待测样品通过特定孔径的过滤器过滤，然后将过滤后的膜放置在培养基上培养。

培养基中的微生物会在膜上形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。

这种方法适用于水样、空气样等液态和气态样品。

4. 分子生物学方法分子生物学方法是一种新兴且快速发展的微生物数量测定方法。

它通过检测和分析微生物DNA或RNA来确定数量。

常用的分子生物学方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。

这些方法可以快速、准确地测定微生物的数量，并且可以检测到少量微生物。

但是，分子生物学方法需要一定的实验设备和技术，并且对样品预处理要求较高。

总结起来，微生物数量的测定方法有直接计数法、培养法、膜过滤法和分子生物学方法等。

南昌大学实验报告学生姓名：学号：专业班级：实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩：实验十细菌菌落总数（CFU）的测定一、实验目的：1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2．了解培养基平板菌落计数原则二、实验基本原理：细菌菌落总数（CFU）是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数。

它是有机污染程度的指标，也是卫生指标。

在饮用水中所测得的细菌菌落总数除说明水有机污染的程度外，还指示该饮用水能否饮用。

但还应当指出的是，水源水中的细菌菌落总数不能说明污染的来源。

因此，结合大肠菌群数以判断水的污染的安全程度就更全面。

我国现行生活饮用水的卫生标准（GB5749－2006）规定：细菌菌落总数在1ml自来水中不得超过80个。

细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合它们的培养基才能将它们培养出来。

然而在实验工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机污染程度。

三、主要仪器设备及耗材：电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，电热培养箱，恒温水浴，冰箱，菌落计数器，放大镜，肉膏蛋白胨脂培养基，灭菌水，灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

四、实验步骤：1．水样的采取供细菌学检验用的水样，必须按无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送，贮存过程中不受污染。

为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样在采取后应立即送检，一般从取样到检验不应超过4小时。

条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验报告单上注明。

（1）生活饮用水（自来水）先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，用灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

（2）池水、河水或湖水应取距水面10—15㎝的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即返回实验室检查，否则需放入冰箱中保存。