微生物数量的测定
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微生物细胞大小和数量的测定
思考题
为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺来 校正？ 在显微镜下直接测定微生物数量有什么 优缺点？
实验五 结束
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20. 12.1720 .12.17 Thursday , December 17, 2020 人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。0 8:47:22 08:47:2 208:47 12/17/2 020 8:47:22 AM 安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20. 12.1708 :47:220 8:47De c-2017 -Dec-2 0 加强交通建设管理，确保工程建设质 量。08:47:2208 :47:220 8:47Th ursday , December 17, 2020 安全在于心细，事故出在麻痹。20.12. 1720.1 2.1708:47:2208 :47:22 December 17, 2020 踏实肯干，努力奋斗。2020年12月17 日上午8 时47分 20.12.1 720.12. 17 追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2 020年1 2月17 日星期 四上午8 时47分 22秒08 :47:222 0.12.17 严格把控质量关，让生产更加有保障 。2020 年12月 上午8时 47分20 .12.170 8:47De cember 17, 2020 作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2 020年1 2月17 日星期 四8时47 分22秒 08:47:2 217 December 2020 好的事情马上就会到来，一切都是最 好的安 排。上 午8时47 分22秒 上午8 时47分0 8:47:22 20.12.1 7 一马当先，全员举绩，梅开二度，业 绩保底 。20.12. 1720.1 2.1708:4708:47 :2208:4 7:22De c-20 牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。202 0年12 月17日 星期四8 时47分 22秒T hursday , December 17, 2020 相信相信得力量。20.12.172020年12月 17日星 期四8 时47分2 2秒20. 12.17
高中生物第1章微生物培养技术第3节测定微生物的数量学案中图版选修1
第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法.前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。
该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。
利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？【提示】血球计数板测出的是全部菌体数,而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。
二、间接计数法的实验设计1．制备土壤稀释液取土壤表层5~10 cm处的土样.准确称取1 g土样，放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min后制成102倍的稀释液.然后进行系列稀释,得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。
2．取样及倒平板3．培养4．观察记录（1）计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30～300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落为宜。
（2）计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品菌数＝错误!×稀释倍数.预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、微生物生长量的测定1.测重量法干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤1～5次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100～105 ℃之间,再称重。
以细菌为例,一个细胞一般重约10－12～10－13g，也可在较低温度（如40 ℃)下进行真空干燥。
湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%~25％。
2．计数法(1)直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
此法的缺点是不能区分死菌与活菌。
计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0。
微生物实验微生物数量和大小测定
目镜测微尺是一块可放入接目镜内旳圆形小玻 片，其中央有精确旳等分刻度。目镜测微尺每小 格所代表旳实际长度不同，需将其放在接目镜中 旳隔板上，测量前，必须先用镜台测微尺进行校 正。
目镜测微尺 镜台测微尺
1.利用镜台测微尺 测定目镜测微尺旳 每格绝对值
2.目镜测微尺每格 长度（um）＝两 重叠线间镜台测微 尺格数×10/两重 叠线间目镜测微尺 格数
测定细胞数量旳常用措施 ➢稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成旳菌落数计数。 优点：活菌计数措施，对设备要求不高。 缺陷：操作复杂。
➢显微镜直接计数法 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺陷：计数成果为活细菌和死菌体旳总和。
➢光电比浊法
光电比浊法是利用在一定旳范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比旳原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 测定时所吸收旳光线越多。
2、细胞大小旳测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜 载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。
三、试验成果
1.计算出目镜测微尺校正成果（物10×和40×） 2.酵母菌大小测定酵母菌大小测定,选择5-8个 酵母菌，测定其40×大小范围。
四、思索题 p51 2(2)
试验(二) 微生物数量旳测定
微生物实验微生物数 量和大小测定
试验(一) 微生物大小旳测定
一、目旳要求
学习使用镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生 物大小。
二、试验原理
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线旳载玻 片，一般是l mm等分为100格，每格长0.01 mm(即10 um) ，用于校正目镜测微尺每格旳相 对长度。
一、目旳要求
1、明确血细胞计数板计数旳原理。 2、掌握使用血细胞计数板进行微 生物计数旳措施。
目镜测微尺 镜台测微尺
1.利用镜台测微尺 测定目镜测微尺旳 每格绝对值
2.目镜测微尺每格 长度（um）＝两 重叠线间镜台测微 尺格数×10/两重 叠线间目镜测微尺 格数
测定细胞数量旳常用措施 ➢稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成旳菌落数计数。 优点：活菌计数措施，对设备要求不高。 缺陷：操作复杂。
➢显微镜直接计数法 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺陷：计数成果为活细菌和死菌体旳总和。
➢光电比浊法
光电比浊法是利用在一定旳范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比旳原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 测定时所吸收旳光线越多。
2、细胞大小旳测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜 载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。
三、试验成果
1.计算出目镜测微尺校正成果（物10×和40×） 2.酵母菌大小测定酵母菌大小测定,选择5-8个 酵母菌，测定其40×大小范围。
四、思索题 p51 2(2)
试验(二) 微生物数量旳测定
微生物实验微生物数 量和大小测定
试验(一) 微生物大小旳测定
一、目旳要求
学习使用镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生 物大小。
二、试验原理
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线旳载玻 片，一般是l mm等分为100格，每格长0.01 mm(即10 um) ，用于校正目镜测微尺每格旳相 对长度。
一、目旳要求
1、明确血细胞计数板计数旳原理。 2、掌握使用血细胞计数板进行微 生物计数旳措施。
实验七微生物数量的测定
实验七微生物数量的测定一、实验目的1.掌握在液态和固态培养基上进行微生物计数的方法。
2.掌握稀释系数的计算方法。
3.了解红外辐射计数器的检测功能和操作方法。
二、实验原理在液体培养基上进行微生物计数的方法属于定量分析中的一项基本技术，其主要原理为先将微生物和加有营养物质的液体平均混合，然后分别取出适当体积，经过一定的稀释，将其等量分配到不同的培养皿内，然后在液体培养基上进行生长，最后根据各个培养皿内微生物生长的数量来计算初始菌落的数目。
其中，常用的标准液体培养基有肉汤、营养琼脂、拟南芥培养基等。
但该方法存在的问题在于，微生物生长的速度会因培养基的不同而有很大区别，如在肉汤培养基上生长较慢，需要长达24小时才能形成充分的菌落，而在营养琼脂培养基上生长则较快，并且易于观察。
此外，该方法要求使用无菌技术，并且在取样时需要注意尽量避免空气中污染菌落的产生，否则将会导致不准确的计数结果。
2.微生物计数固体培养基法在固体培养基上进行微生物计数的方法是将微生物标本均匀涂于固体培养基上，然后生长出菌落进行计数。
与液体培养基相比，该方法在菌落的形成方面更直观，且繁殖数目相对更多，故计数更为准确。
常用的固体培养基有营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、血液琼脂等。
但该方法存在的问题在于，菌落大小、形状、颜色等因素均可能影响计数结果，在计数时需要注意与目测直接形状相同的菌落合并计算，否则会造成漏计或重复计数的情况。
稀释是将一定量的菌液，通过逐步加入相等体积的稀释液而逐渐降低其菌落总体载量的过程。
通过分析稀释液与菌落的比例，就可以得到相对菌落的绝对数量。
其中，稀释系数是指菌液按递减顺序与相应稀释液的混合比例。
4.红外辐射计数器红外辐射计数器是一种基于消光和反射原理的微生物计数仪器，其原理是通过辐射源向样品发射一定频率的红外辐射，并接收样品的反射光信号，在计算机系统的驱动下对数码化数据进行处理，最终得到表示原始样品生化物数量的结果。
微生物量的测定方法
微生物量的测定方法
常见的微生物量测定方法包括：
1. 平皿计数法：将样品按一定稀释倍数加入琼脂平皿中，培养后通过计数器统计微生物在平皿上的数量，以此计算原样品中微生物的数量。
2. 滤膜计数法：将样品过滤后将滤膜放在富含营养的琼脂平板上培养，通过计数器统计滤膜上微生物的数量，以此计算原样品中微生物的数量。
3. 光密度法：利用菌落浑浊作用测定微生物规模大小的方法，称为“比色法”，并以光密度来表示菌落数量的多少。
4. 电极测定法：利用特定的氧化还原反应来测定微生物量，例如，生物化学需氧量（BOD）和化学需氧量（COD）。
5. 溶解氧测定法：利用溶解氧在水中的含量来推算微生物的存在量。
6. 分子生物学方法：利用PCR、DNA芯片等技术检测微生物数量，也可通过它们的遗传物质（如rRNA）来推算微生物的存在量。
实验七微生物数量的测定
五、实验报告
1、结果记录： 将计数结果记录下表。A表示五个中方格 中的总菌数。B稀释倍数为102。
注:1 mL菌液总数=A/5×25×104×B=5×107×A
五、实验报告
1、思考题： （1）在显微镜下直接测定微生物数量有什么优 缺点？
（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误 差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力 求准确？ （3）某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率 请设计1-2种可行的检测方法。
5. 计算方法：
酵母菌细胞数/mL= （X1+X2+X3+X4+X5） 25（或16）X 10 X 1000 x 稀释倍数 X 5
6. 注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和 右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时， 若芽体超过母体一半以上，就按单个酵母计数。 7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用 吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
下次实验：微生物大小的测定
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1. 取清洁无油的血球计数板（在显微镜下检查，如不 干净清水冲洗，不可用硬毛刷刷洗），在计数室上面 加盖玻片。
2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴， 使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 3. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野 中央。 4. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值， 然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出 一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌 数。
实验七
微生物数量的测定
一、目的要求
1．明确血细胞计数板计数的原理 2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的 方法。
二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂 繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般 以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体 生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。 测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数 法、光电比浊法等。 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液 置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上， 于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的 方法。
微生物大小的测定及数量的测定
微生物的大小测定与数量的测定一、实验目的1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。
2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。
3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。
二、实验内容1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。
（1）目镜测微尺和镜台测微尺目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在 5 毫米内作50 等分刻制的，每一等份为0.1 毫米。
另一规格是 5 毫米作100 等分，每等分为0.05毫米。
镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在1 毫米内作100 等分刻成的，每等分10 微米。
（2）目镜测微尺校正的方法将镜台测微尺上面的透镜片取下，把目镜测微尺放在光阑上，刻度朝下。
把镜台测微尺置于载物台上，用低倍物镜检视，使测微尺位于视野中央。
注意区分视野内两把尺哪个是目镜测微尺，哪个是镜台测微尺。
利用推进器或转动目镜使两尺的第一条线（0 线）互相重合，然后找出另一条重合线。
如重合线较多选取距0 线最远的重合线。
记下两条重合线之间两尺的刻度，依公式算出目镜测微尺的校正值。
目镜测微尺校正值（每刻度微米数）= 两重叠刻度间镜台测微尺格数×10两重叠刻度间目镜测微尺格数2．用美兰水浸片法观察酿酒酵母（saccharomyces cerevisiac）的形态，注意出芽繁殖和死活酵母菌的染色形态，并测量大小。
3．用血球板计算黑曲霉孢子的数量。
（1）血球计数板3．用血球板计算黑曲霉孢子的数量。
（1）血球计数板利用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。
因为计数板载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。
血球计数板是一只特制载玻片。
载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。
计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16 个中方格，每中方格又分成25个小方格。
微生物实验五微生物数量的测定
实验五 微生物数验目的
1、明确血球计数板计数的原理 2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术
二、实验原理
镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮 液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌 或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得 罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板 的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用 油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细 菌不易看清。
二、实验原理
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽 而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分 隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共 分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物 的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中 方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大 方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点， 即每个大方格都由400个小方格组成。
3、加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴
管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。样品要均 匀充满计数室，不可有气泡。
4、显微镜计数 加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台
上，先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜 （40倍）进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则， 不容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的酵母 菌，可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查 左不查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时， 即可计作两个细胞。
死细胞数
死亡率=
×100%
1、明确血球计数板计数的原理 2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术
二、实验原理
镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮 液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌 或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得 罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板 的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用 油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细 菌不易看清。
二、实验原理
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽 而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分 隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共 分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物 的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中 方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大 方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点， 即每个大方格都由400个小方格组成。
3、加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴
管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。样品要均 匀充满计数室，不可有气泡。
4、显微镜计数 加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台
上，先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜 （40倍）进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则， 不容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的酵母 菌，可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查 左不查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时， 即可计作两个细胞。
死细胞数
死亡率=
×100%
测定微生物总数的方法
测定微生物总数的方法测定微生物总数是微生物学研究中的一项重要任务，它可以帮助我们了解微生物在环境中的分布和数量。
本文将介绍几种常用的测定微生物总数的方法。
一、直接计数法直接计数法是最直接、最常用的测定微生物总数的方法之一。
它通过使用显微镜观察样品中的微生物细胞数目来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、土壤样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于玻璃片上，用显微镜观察。
3. 在显微镜下，使用目镜和物镜进行放大观察，并使用计数室或计数网格进行计数。
4. 统计不同视野中的微生物数量，并计算平均值，从而得到微生物总数。
二、培养法培养法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品在培养基上培养并生长，然后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取适量的样品，如空气、食品、药品等，制备适当的稀释液。
2. 取一定量的稀释液接种于含有富营养物的培养基上。
3. 将培养基培养在适当的温度和湿度条件下，使微生物生长繁殖。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
三、膜过滤法膜过滤法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品过滤到膜上，然后将膜放置在培养基上进行培养和生长，最后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 将稀释液通过膜过滤装置过滤到膜上。
3. 将膜放置在含有富营养物的培养基上进行培养和生长。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
四、荧光显微镜法荧光显微镜法是一种高级的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品染色，并利用荧光显微镜观察和计数荧光染色的微生物细胞来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于载玻片上，进行定性或定量染色。
微生物数量的测定方法
微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，也存在于人体内外。
了解微生物的数量对于环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有重要意义。
本文将介绍几种常用的微生物数量测定方法。
1. 直接计数法直接计数法是最直接、最常用的微生物数量测定方法之一。
它通过显微镜观察和计数来确定微生物的数量。
首先，将待测样品制备成适当的悬浮液，然后在显微镜下观察，并使用计数器进行计数。
这种方法适用于细菌和酵母等较大的微生物。
但是，由于显微镜观察需要较高的技术水平和时间，所以无法快速测量大量样品。
2. 培养法培养法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过培养微生物并计数生长的菌落来确定数量。
首先，将待测样品制备成适当的培养基，然后在恰当的温度和湿度条件下培养一段时间。
培养基中的微生物会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于大部分微生物，但是它需要一定的培养时间，并且某些微生物可能无法在常规培养基上生长。
3. 膜过滤法膜过滤法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过将待测样品过滤到膜上，并将膜培养在适当的培养基上来确定数量。
首先，将待测样品通过特定孔径的过滤器过滤，然后将过滤后的膜放置在培养基上培养。
培养基中的微生物会在膜上形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于水样、空气样等液态和气态样品。
4. 分子生物学方法分子生物学方法是一种新兴且快速发展的微生物数量测定方法。
它通过检测和分析微生物DNA或RNA来确定数量。
常用的分子生物学方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
这些方法可以快速、准确地测定微生物的数量，并且可以检测到少量微生物。
但是，分子生物学方法需要一定的实验设备和技术，并且对样品预处理要求较高。
总结起来，微生物数量的测定方法有直接计数法、培养法、膜过滤法和分子生物学方法等。
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❖ 计算：
➢ 1mL菌液中总菌数 =A/5*25*104*B=50000*A*B
➢ 1mL菌液中总菌数 =A/5*16*104*B=32000*A*B
其中B为稀释倍数。
注意事项
❖ 对于出芽的酵母菌，芽体 达到母细胞大小一半时， 即可作为两个菌体计算。
❖ 对于压线酵母，按照数上 不数下、数左不数右的原 则计数
❖无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是 400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为 lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm ，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。
计数方法
❖使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌 数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（ 计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总 菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成每 毫升菌液中微生物细胞的数量。
光电比浊计数法优缺点
❖ 优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。
❖ 缺点：
➢ 光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的 波长的影响；
➢ 对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养 条件制作标准曲线；
➢ 对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不 能用此法。
器材
❖菌种 酿酒酵母培养液
❖仪器或其他用具 分光光度 计，血细胞计数板，显微 镜，试管，吸水纸，无菌 吸管，无菌生理盐水等。
➢ 不能区分死菌与活菌，所得为总数； ➢ 不适于对运动细菌的计数。
常用计菌器
❖常用计数器有血球计数板(血细胞计数板) 、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等。
❖各种计数板的计数原理相同，只是血球计 数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数 较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌 器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直 接计数细菌。
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。
微生物数量的测定
❖微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现 为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。
❖测定微生物数量的主要方法：
•显微镜直接计数法（不辨死活） •平板菌落计数法（形成菌落的微生物） P32 •光电比浊法（不用于颜色太深的样品） •测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量） •测定细胞总氮量或总碳量（适于浓度55
•实验十二、光电比浊计数法
•目的要求
❖了解光电比浊计数法的原理。 ❖学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。
基本原理
❖ 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射 及吸收作用使光线的透过量降低。
❖ 在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反 比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以 由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌 数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标准 曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标 准曲线中查出对应的菌数。
• 血球计数板
Petroff-Hauser计菌器
•Hawksley计菌器
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
活材料：
实验器材
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液
。
其他器材：
显微镜、血球计数板 、电吹风、盖玻片（ 22mm×22mm）、 吸水纸、计数器、滴 管、擦镜纸。
实验方法
1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以 每个小方格中5～10个菌为宜）。
2、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻 片。
实验十一、显微镜直接计数法
目的要求
❖了解血球计数板的构造、计数原理和计 数方法；
❖掌握显微镜下直接计数的技能。
❖显微镜直接计数法是将小量待测样品的 悬浮液置于一种特别的具有确定面积和 容积的载玻片上，于显微镜下直接计数 的一种简便、快速、直观的方法。
直接计数法优缺点
❖ 优点：直观、快速、操作简单。 ❖ 缺点：
3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘 入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。
4、加样后静止5min，将计数板置显微镜载物台上，先用 低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强 ）
5、计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用 电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。
3、测OD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长 560nm处用1cm比色杯测定上述各菌液的OD值 。
4、以OD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制 标准曲线。
样品测定
1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐 水适当稀释。
2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释 后菌悬液的光密度。
3、计算：根据所测得的光密度值，从标准 曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍 数就得到原液中细菌数。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。
•光密度值
操作步骤
❖ 标准曲线的制作 ❖ 样品测定
•每毫升细胞数
标准曲线的制作
1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计 数酿酒酵母菌悬液。（ 2×108菌/mL ）
2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用 无菌生理盐水进行两倍梯度稀释,共稀释6个浓度: 1×108、 5×107、 2.5×107、 1.25×107、 6.25×106、 3.125×106。