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等温滴定量热法（ITC）等温滴定量热技术摘要：⽣物⼤分⼦可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产⽣，要么吸收。
⽣物⼤分⼦与配体相互作⽤的定量描述需要确定反应过程中热⼒学参数的变化。
相互作⽤过程中产⽣的热量变化可以⽤量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是⼀种监测由结合成分的添加⽽起始的任何化学反应的热⼒学技术，它已经成为鉴定⽣物分⼦间相互作⽤的⾸选⽅法。
它通过⾼灵敏度、⾼⾃动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录⼀个变化过程的量热曲线，原位、在线和⽆损伤地同时提供热⼒学和动⼒学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了⽣物分⼦相互作⽤的真实写照。
由于⼏乎所有的⽣化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很⼴泛的应⽤，它可以应⽤于蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤、蛋⽩质折叠/去折叠、蛋⽩质-⼩分⼦相互作⽤、酶-抑制剂相互作⽤、酶促反应动⼒学、药物-DNA/RNA相互作⽤、RNA折叠、蛋⽩质-核酸相互作⽤、核酸-⼩分⼦相互作⽤、核酸-核酸相互作⽤、⽣物分⼦-细胞相互作⽤等⽅⾯。
关键字：等温滴定量热技术、相互作⽤、热⼒学商业化的测量⽣物分⼦相互作⽤热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被⼴泛应⽤。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作⽤的常⽤⽅法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易⽤。
分⼦识别是⼀个复杂的过程，是⽣命活动的基础。
⽣物分⼦识别过程需要结合反应的热⼒学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量⽐（n）、反应焓变（?H）、熵变（? S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热⼒学参数，⽤来表征⽣物分⼦间的相互作⽤。
itc等温滴定量热仪原理
ITC等温滴定量热仪原理
ITC等温滴定量热仪是一种采用滴定法进行热量测量的仪器，其工作原理主要可以分为以下几个部分：
1. 恒温环境：该仪器是由一个恒温环境构成的，该恒温环境的
环境温度可以调节，它可以精确地保持恒温，以保证测量的准确度。
2. 测量样品：在测量过程中，将样品放置在该仪器的测量室中，使其恒温，并通过恒温循环系统对样品进行持续加热，以获得热量测量结果。
3. 探头：该仪器内部设有一个探头，用于测量样品表面的温度，以及样品内部温度和溶剂滴定的温度，并可通过探头自动调节样品加热的程度，以达到精确测量的要求。
4. 滴定头：该仪器还设有一个滴定头，用于将溶液滴入样品中
进行滴定测试，以获得热量测量结果。
5. 计算机：该仪器设有一台电脑，用于记录测量结果，并对测
量结果进行分析，以计算出最终的测量结果。
以上是ITC等温滴定量热仪的工作原理，它是一种高精度的仪器，可以精确测量热量，并可以用于测定各种物质的热量测量。
微量热等温滴定量热仪（ITC）一、仪器用途：微量热等温滴定量热仪（ITC）广泛应用于小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
二、技术指标和参数（带*者为必须具备指标）：1、应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
2、应用Peltier电子温控系统保持样品室温度*3、短期噪音水平：0.2 ncal/s4、参照重复性：Mean≤1.5 μcal5、操作温度范围：2℃~80℃*6、平衡时间＜6min（从25℃至5℃）*7、温度稳定性为0.00015℃/秒（25℃时）8、最小响应时间：10 S9、测量池材质：哈司特镍碳合金(Hastelloy TM)10、测量池体积：200μl*11、实际样品需求量不超过280ul；*12、测量池类型：硬币状，固定式13、注射器：40μl，自动滴定14、最小注射体积：0.1μl*15、在线自动清洗平台，确保清洗效果的一致性及客观性，方便、快捷、易操作，减少实验操作者的劳动强度16、热补偿方式：功率反馈*17、附带控制系统，内装Origin 7数据分析软件*18、软件要求内置7种以上分析模型：单一位点，两位点，顺序位点，竞争性位点，酶动力学，解离等；*19、系统可设定三种反馈模式（高、中、低），可根据不同需要灵活选择；20、结合常数检测范围：直接检测法-从毫摩尔到纳摩尔浓度范围（102~109 M-1）间接检测法-从纳摩尔到皮摩尔范围（109~1012M-1）*21、搅拌速率：1000转以上；22、质保期1年。
23、进样针5根。
三、技术服务要求：1、供应商必须提供仪器的现场安装调试并达到投标书指标要求的技术性能，并同时在现场对用户进行操作培训。
2、仪器在调试验收合格后，提供一年免费保修服务，在保修期内，所有服务及配件全部免费，保修期外，仪器终身维修。
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
一、实验目的：
1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用
2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作
3.简要分析实验结果。
二、实验原理：
在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：
图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：
C = 滴定池中的蛋白浓度/ K
D = [M]t/ KD × N
C值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线。
用单位点模型来验证数据。
化学计量、结合常数及焓的数值都有显示。
三、实验步骤：
1.清洗样品池和注射池
2.注射器加样
①将装有100μl样品的PE管放入样品管槽；
②将注射器手动移动到“Rest Position”，左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，感到拧到底即可，切记不能拧死，否则注射器会损坏；
③在“Instrument Control”界面中点击“Syringe Fill”，检查正常后点击OK；
④将注射器移动到“Loading Position”针头插入到试管中，点击OK，开始吸取样品，待加满后取下白色细管，放回原位；
3.样品池加样
①用玻璃注射器吸取300μl的样品，轻弹注射器壁赶出气泡；
②将注射器对准样品池中间小孔慢慢插入，轻触底部后抬起1mm；
③用手稳住针筒，缓慢推入样品至样品溢出样品孔，重复吸取赶出样品池中的气泡；
④同样的，在参照池中加入水和Buffer；
4.设置相关的试验参数：总加样次数，样品池温度，搅拌速度，单词滴定体积和间隔时间
四、实验结果及数据处理
由图中曲线可以看出，滴定曲线较好，蛋白之间的亲和常数为K D=5.80×105（±3.92×104）; 焓变△H=-3134±12.66cal/mol=-13106.39±52.94J/mol;
反应熵变△S=15.9cal/mol/deg=66.49J/mol/deg;
结合比N=1.09，即为1:1.09；
反应的自由能为ΔG =- RT lnK D =-8.314×298×ln5.80×105≈-32.87KJ/mol;
ΔG = ΔH–TΔS=(-13106.39-298×66.49)=-32.92KJ/mol。
