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等温滴定量热法（ITC）等温滴定量热技术摘要：⽣物⼤分⼦可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产⽣，要么吸收。
⽣物⼤分⼦与配体相互作⽤的定量描述需要确定反应过程中热⼒学参数的变化。
相互作⽤过程中产⽣的热量变化可以⽤量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是⼀种监测由结合成分的添加⽽起始的任何化学反应的热⼒学技术，它已经成为鉴定⽣物分⼦间相互作⽤的⾸选⽅法。
它通过⾼灵敏度、⾼⾃动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录⼀个变化过程的量热曲线，原位、在线和⽆损伤地同时提供热⼒学和动⼒学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了⽣物分⼦相互作⽤的真实写照。
由于⼏乎所有的⽣化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很⼴泛的应⽤，它可以应⽤于蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤、蛋⽩质折叠/去折叠、蛋⽩质-⼩分⼦相互作⽤、酶-抑制剂相互作⽤、酶促反应动⼒学、药物-DNA/RNA相互作⽤、RNA折叠、蛋⽩质-核酸相互作⽤、核酸-⼩分⼦相互作⽤、核酸-核酸相互作⽤、⽣物分⼦-细胞相互作⽤等⽅⾯。
关键字：等温滴定量热技术、相互作⽤、热⼒学商业化的测量⽣物分⼦相互作⽤热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被⼴泛应⽤。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作⽤的常⽤⽅法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易⽤。
分⼦识别是⼀个复杂的过程，是⽣命活动的基础。
⽣物分⼦识别过程需要结合反应的热⼒学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量⽐（n）、反应焓变（?H）、熵变（? S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热⼒学参数，⽤来表征⽣物分⼦间的相互作⽤。
等温滴定量热法在一次实验中直接进行关于生物分子亲和力和热力学特性的无标记测定等温滴定量热法（ITC）是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。
它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。
ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。
ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。
通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数（K D）、反应化学量（n）、焓（∆H）和熵（ΔS）。
这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。
ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。
更深入了解结构－功能关系，让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。
测量原理：等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。
该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓，无需使用标记。
发生结合时，热不是被吸收就是被释放，这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。
工作原理热核心微量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品。
微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。
热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。
进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。
将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。
将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。
将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。
如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。
进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。
测得的热量与结合量成正比。
结果和数据分析在下面的示例中，反应是放热的，这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。
随着两个池的温度恢复到同一水平，信号也回到其起点。
将第二小份配体试样注入到样品池中，同样，微量热计补偿所检测到小幅热量变化。
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
微量热等温滴定量热仪（ITC）一、仪器用途：微量热等温滴定量热仪（ITC）广泛应用于小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
二、技术指标和参数（带*者为必须具备指标）：1、应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
2、应用Peltier电子温控系统保持样品室温度*3、短期噪音水平：0.2 ncal/s4、参照重复性：Mean≤1.5 μcal5、操作温度范围：2℃~80℃*6、平衡时间＜6min（从25℃至5℃）*7、温度稳定性为0.00015℃/秒（25℃时）8、最小响应时间：10 S9、测量池材质：哈司特镍碳合金(Hastelloy TM)10、测量池体积：200μl*11、实际样品需求量不超过280ul；*12、测量池类型：硬币状，固定式13、注射器：40μl，自动滴定14、最小注射体积：0.1μl*15、在线自动清洗平台，确保清洗效果的一致性及客观性，方便、快捷、易操作，减少实验操作者的劳动强度16、热补偿方式：功率反馈*17、附带控制系统，内装Origin 7数据分析软件*18、软件要求内置7种以上分析模型：单一位点，两位点，顺序位点，竞争性位点，酶动力学，解离等；*19、系统可设定三种反馈模式（高、中、低），可根据不同需要灵活选择；20、结合常数检测范围：直接检测法-从毫摩尔到纳摩尔浓度范围（102~109 M-1）间接检测法-从纳摩尔到皮摩尔范围（109~1012M-1）*21、搅拌速率：1000转以上；22、质保期1年。
23、进样针5根。
三、技术服务要求：1、供应商必须提供仪器的现场安装调试并达到投标书指标要求的技术性能，并同时在现场对用户进行操作培训。
2、仪器在调试验收合格后，提供一年免费保修服务，在保修期内，所有服务及配件全部免费，保修期外，仪器终身维修。
ITC200简易操作指南1ITC200介绍等温滴定量热仪ITC200由控制器和主机组成。
其中主机包括塔台，滴定注射器，测量池以及清洗单元等部件。
溶液瓶是清洗单元的一部分，通过管道和清洗平台相连。
主机上方白色托盘内的金属槽内是 ITC200的样品池和参比池。
2实验准备2.1仪器的清洁操作前需要确认ITC200的样品池是否洁净，可以通过向样品池，参比池和滴定注射器中都加入脱气的超纯水，然后通过水滴水的实验观察噪音水平，确认是否洁净。
如果样品池比较脏，可使用5%-20 %的去垢剂 Contrad 70（或 Decon 90）浸泡半小时，浸泡时同时将样品池加温到50 摄氏度，以彻底去除黏附的杂质。
随后用Cell water rinse 命令，用超纯水清洗样品池。
使用 syringe wash 命令，清洗滴定注射器。
清洗后再通过水滴定实验进行确认。
2.2样品的准备滴定与被滴定样品需要溶解在完全一致的缓冲液中，如果缓冲液不一致，则需通过透析或者超滤等手段进行置换，并保留透析或者超滤尾液，作为参比缓冲液。
通常将大分子的蛋白作为被滴定样品，放于样品池中，通常浓度为 50 µM, 参比池中放入超纯水。
将小分子或相互作用的另一方装于滴定注射器中，通常浓度为样品池中浓度的10-15 倍。
3实验设计ITC200的控制软件整合了方便的实验设计的功能。
在软件的Experimental design 标签页中输入预估的相互作用的化学计量比（N），选择相互作用体系，软件将自动估计解离平衡常数(K D)；输入反应焓变（ΔH）后，软件就会自动给出预估的实验结果图，以及推荐使用的样品浓度。
4实验确定实验用的样品浓度后，就可对样品池和滴定针进行加样。
4.1样品池加样取下上样针，检查是否干净，并用缓冲液润洗。
，用上样针慢慢吸取约300 ul的样品，小心去掉针管中的气泡。
将上样针垂直插入样品池，直到针头触到样品池底部，然后向上提起1 mm。
