间接免疫荧光法测ANA PPT课件

室中。 3、先观察对照孔，特别是阴性对照应无非特异荧光。
六、报告要求 间接免疫荧光法检测抗核抗体实验原理、结果。
本节内容结束
光强度和免疫荧光核型。
二、试剂材料 1、0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。 2、荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体。 3、95％乙醇。 4、荧光显微镜、37℃温箱、吹干机。 5、玻片缸、湿盒、试管、吸管、玻片、蜡笔等。
三、操作方法
（一）鼠肝片的制备 1、取小白鼠一只，断颈处死。取其肝脏，用生 理盐水洗去残血，吸水纸吸干。 2、印片：小镊子夹取肝脏，剪刀剪成平断面， 将断面印至玻片上，直径为0.5厘米左右的薄膜 （不宜过厚），每片可涂三个，立即吹干。 3、固定：将上述印片放入95％乙醇玻片缸中固 定5分钟， 取出吹干。
3、滴加荧光0min。
4、同2。
5、放荧光显微镜下观察结果。
四、结果判断
阴性标本仅可见极淡绿色的非特异的荧光背景，有时还可见 到与核形态大小相仿的空隙状暗区。
阳性对照荧光染色强。
常见的ANA荧光核型及临床意义
均质型（H）： 细胞核均匀着染荧光
• 相关抗体：抗核仁特异的低分子量RNA、抗 RNA聚合酶-1、抗u3RNP、抗PM-Scl。 • 意义：高滴度核仁型ANA对诊断硬皮病具有一 定特异性，偶尔见于SLE、雷诺现象。
HEp-2 cell IIF Nucleolar ANA
五、注意事项
1、制备鼠肝涂片时，涂片不宜过厚。 2、应立即观察实验结果，否则荧光易猝灭。观察结果最好在暗
高滴度的斑点型ANA常见于MCTD，同时也可 见于SLE、PSS（进行性系统性硬化症）、SS等
核膜型（M）/周边型： 细胞核 的周边形成荧光环。
• 相关抗体：抗dsDNA抗体 • 意义：高滴度周边型ANA几乎仅见于SLE， 特别是活动期SLE，周边型对SLE的诊断价值 极大，且提示病情活动。

• 3、滤纸试验< 或=5mm/min或角膜染色指数>或=4为阳性。
• 4、下唇黏膜活检的单核细胞浸润灶>或=1/4mm2为阳性。
• 5、腮腺造影、腮腺同位素扫描、唾液流率中有任一项阳性。
• 6、血清抗SSA，抗SSB抗体阳性。
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干燥综合征诊断标准
凡具备上述6项中的至少4项，并除外另一结蹄组 织病，如淋巴瘤、爱滋病、结节病、移植物抗宿 主病，则可确诊为原发性干燥综合征。已有某一 肯定结蹄组织病，同时有上述第1或第2，另又有 第3、4、5项中的2项阳性，可确诊为继发性干燥 综合征。
• CREST综合征，具体其中5条症状的3条，或3条以上加着 丝点抗体阳性可诊断。
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干燥综合征诊断标准
• 1、有3个月以上的眼干涩感，或眼有沙子感，或每日需用3次 以上的人工泪液。凡有其中任一者为阳性。
• 2、有3个月以上的口干症，或进干食时须用水送下，或有反 复出现或持续不退的腮腺肿大。凡有其中任一者为阳性。
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原发性胆汁性肝硬化
(1)有胆汁淤积的生化指标，主要是碱性磷酸酶升高；
(2) AMA阳性；
(3) 组织学上有非化脓性胆管炎和小叶间胆管损伤的表现。
• 符合以上三条中的两条即可确诊PBC。
• 关于PBC诊断的建议：
• （1）对于PBC特异性抗体阴性的患者，需肝穿刺活检以 明确诊断。此外，对于转氨酶水平异常升高和/或IgG升高 的患者，肝穿刺活检可以发现是否为其他疾病或合并其他 疾病。
ANA
核仁型：Scl-70、RNA多聚酶、PM-Scl和原纤维蛋白….. 核浆点型（着丝点型）：着丝点（CENP） 、核点……
胞浆颗粒型：线粒体、Jo-1、核糖体……

• 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
阳性对照：阳性血清+荧光标记物
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，
阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
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4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就
有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜、玻片架、滤. 纸、37℃温箱等。
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实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体
标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
体。
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试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
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3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
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的准确性和可靠性。
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE

自身免疫抗体检测及临床意义
抗核抗体（ANA）
检测与临床应用
抗核抗体的定义
传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。
广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理 解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称
ANA的靶抗原分布：
细胞核
整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。
核均质: 抗核小体抗体(ANuA)
靶抗原: dsDNA-组蛋白-复合物的构象决定簇
方法: IIFA ELISA, Blot
临床意义: SLE, 阳性率 50-95% (特异性100%)
抗核小体 ELISA: 敏感性、特异性、疾病活动度
分组
n
抗核小体阳性
SLE
233
干燥综合症
41
皮肌炎/多肌炎
40
系统性硬化症
33
类风湿/骨关节炎
60
强直性脊柱炎
20
健康对照组
31
特异性
225
144 (61.8%) 1 (2.4%) 1 (2.5%) 1 (3.0%) 1 (1.7%) 0 0 98.2%
ANuA 与疾病的活动性相关性强 (SLE DAI score)
Su et al., Clin Immunol 122: 115-120, 2007
建议： • IIFT-ANA仍然为ANA检测的金标准 • 医院或商业诊断所应用其它ANA检测方法时，必须要求为临床大夫提供足够 的数据证明其它ANA检测方法与IFT比较具有同样或更高的敏感度和特异性 • 实验室在ANA报告当中必须注明ANA检测方法
ANA筛查: 间接免疫荧光法(IFT)
抗原谱完整 (细胞核、细胞浆) 检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性 基质组合: HEp-2细胞+灵长类肝

原因1: 高滴度抗体在低稀释倍数时可能被非特异性反应遮盖
AMA (鼠肾)
抗表皮基底膜抗体 (喉舌) 抗Yo抗体 (猴小脑)
pANCA (人中性粒细胞)
1:100
1:10
1:10
1:1
1:1000
1:100
1:100
EUROIMMUN 1:10
推荐一个标本平行作两个稀释度 1:100和1:1000 (2)
EEUURROOIIMMMMUUNN
ANA筛查: 间接免疫荧光法(IFT)
抗原谱完整 (细胞核、细胞浆) 检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性 基质组合: HEp-2细胞+灵长类肝
EUROIMMUN
HEp-2细胞+ 灵长类肝
- 确认IIF的荧光模型，如 - 肌动蛋白 - 核糖体P蛋白
- 区分IIF的荧光模型，如： -着丝点 核点 - SS-A/-B Sm/RNP Ku
- 还可获得其它结果，如： - ANCA -肌内膜/谷氨酰胺转移酶
EUROIMMUN
确认IIF的荧光模型
HEp-2细胞
灵长类肝
肌动蛋白
核糖体 P蛋白
EUROIMMUN
区分IIF的荧光模型
HEp-2 细胞
灵长类肝
1:10000
抗体滴度
EEUURROOIIMMMMUUNN
欧蒙实验室推荐的ANA稀释方案
起始稀释度：1:100 1:1,000
报告结果
抗体滴度： 1:100 1:1,000
1:320
1:3,200 1:10,000
抗体浓度范围：
（＋） ＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋
EEUURROOIIMMMMUUNN
推荐一个标本平行作两个稀释度 1:100和1:1000 (1)

荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就 有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一Βιβλιοθήκη （内铺一层浸湿的纱布垫）3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •

荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
间接免疫荧光讲
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原 反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧 光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗 原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病 毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免 疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知 未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上， 在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然 后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标 记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步 发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和 已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗 体。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

注意: 为防止破坏基质，不要擦拭反应区的 间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟。
实验步骤八: 冲洗
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液, 流水冲洗载片, 然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小 杯中浸洗至少5分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl) 伊文氏蓝进行复染。
然后再进行下一个载片的操作。
实验步骤十: 结果判断
➢荧光显微镜下观察荧光。
结果判读:
荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞, 不发
荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性, 否
则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
【均质型】 细胞核呈均匀一致的荧光
【核仁型】 核仁部分呈现荧光
某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富
ANA检测的意义
有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；
观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理
【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
✓滴度定义: 与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察 到特异性荧光反应的最高稀释度
【临床意义】
总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一 个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫 性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测 各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病 情观察、预后及治疗评价有重要意义。
未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－ 100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混 合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁 性肝硬化等。

[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺， 比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
[方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含
100u/ml肝素）的试管中，混匀。
2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀 释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保 持两者界面清晰。（关键）
First antibody secondary antibodyfluorochrome
原理
PBMC
Target cells
材料
• PBMC • 兔抗人白细胞血清 (Ab1) • FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2)
方法
• 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背 面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。
间接免疫荧光
武汉大学基础医学院 免疫学教研室 潘勤
外周血单个核细胞分离
----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理] 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、
单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。 红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋 巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为 1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重 的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以 分离。
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。
4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核 细胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的离心管中，混匀。
5、室温下，1500 rpm离心10 min。
6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混 匀